347 12.7*1.24mm Roesvrye staal opgerolde buis, Molekulêre meganisme van sinchroniese elektrostatiese kondensasie en samevoeging van α-sinuklein en tau

Dankie dat jy Nature.com besoek het.Jy gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).Daarbenewens, om deurlopende ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.
Sliders wat drie artikels per skyfie wys.Gebruik die terug- en volgende-knoppies om deur die skyfies te beweeg, of die skyfiebeheerknoppies aan die einde om deur elke skyfie te beweeg.

347 vlekvrye staal pyp spesifikasie

347 12.7*1.24mm Roesvrye staal opgerolde buis

Buite deursnee: 6,00 mm OD tot 914,4 mm OD, Groottes tot 24” NB beskikbaar Uit voorraad, OD Grootte Staalbuise beskikbaar Uit voorraad

SS 347 pypdiktereeks: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ens. (0.5-12mm) Of nie-gereelde grootte om aangepas te word soos benodig

Tipe: SS 347 Naatlose Pype |SS 347 ERW Pype |SS 347 Gelaste pype |SS 347 vervaardigde pype |SS 347 CDW-buise, LSAW-pype / naatgesweis / herteken

Vorm: SS 347 ronde pype/buise, SS 347 vierkante pype/buise, SS 347 reghoekige pyp/buise, SS 347 opgerolde buise, SS 347 “U” vorm, SS 347 Pankoekrolle, SS 347 hidrouliese buise

Lengte: Enkel Willekeurig, Dubbel Ewekansig & Vereiste Lengte Einde: Gewone einde, skuins einde, trapvlak

Eindbeskerming: Plastiekdoppies |Buiteafwerking: 2B, No.4, No.1, No.8 Spieëlafwerking vir vlekvrye staalpype, afwerking volgens klantvereistes

Afleweringstoestand: uitgegloei en gepekel, gepoleer, helder uitgegloei, koud getrek

Inspeksie, toetsverslae: Meultoetssertifikate, EN 10204 3.1, Chemiese verslae, meganiese verslae, PMI-toetsverslae, visuele inspeksieverslae, derdeparty-inspeksieverslae, NABL-goedgekeurde laboratoriumverslae, vernietigende toetsverslag, nie-vernietigende toetsverslae

Verpakking: verpak in houtbokse, plastieksakke, staalstroke saamgebondel, of volgens klante se versoeke

Spesiale: Groottes en spesifikasies anders as hierbo kan op versoek vervaardig word

SS 347 pyp grootte reeks: 1/2 duim NB, OD tot 24 duim

ASTM A312 347: Naatlose en reguit-naat gelaste austenitiese pyp bedoel vir hoë temperatuur en algemene korrosiewe diens.Vulmetaal word nie toegelaat tydens sweiswerk nie.

ASTM A358 347: Elektriese samesmelting gelaste austenitiese pyp vir korrosiewe en/of hoë temperatuur diens.Tipies word slegs pyp tot 8 duim volgens hierdie spesifikasie vervaardig.Byvoeging van vulmetaal word tydens sweiswerk toegelaat.

ASTM A790 347: Naatlose en reguit-naat gelaste ferritiese/austenitiese (dupleks) pyp bedoel vir algemene korrosiewe diens, met 'n besondere klem op weerstand teen spanningskorrosie-krake.

ASTM A409 347: Reguit- of spiraalnaat elektriese samesmelting-gesweis austenitiese ligte muurpyp met groot deursnee in groottes 14” tot 30” met mure Sch5S en Sch 10S vir korrosiewe en/of hoë mure

ASTM A376 347: Naatlose austenitiese pyp vir hoëtemperatuurtoepassings.

ASTM A813 347: Enkelnaat, enkel- of dubbelgesweisde austenitiese pyp vir hoë temperatuur en algemene korrosiewe toepassings.

ASTM A814 347: Koudverwerkte gelaste austenitiese pyp vir hoë temperatuur en algemene korrosiewe diens.

347H vlekvrye staalpype Chemiese samestelling

Vlekvrye staal 347H pyp meganiese eienskappe

Vlekvrye staal 347H pype Fisiese eienskappe

Ekwivalente grade vir 347H-vlekvrye staalpyp

Amyloïed alfa-sinuklein (αS) samevoeging is 'n kenmerk van Parkinson se siekte en ander sinukleinopatiee.Onlangs is die tau-proteïen wat algemeen met Alzheimer se siekte geassosieer word, geassosieer met αS-patologie en gevind om saam te lokaliseer in αS-ryke insluitings, alhoewel die molekulêre meganisme van samevoeging van die twee proteïene onduidelik bly.Ons rapporteer hier dat die αS-fase in vloeibare kondensate skei via elektrostatiese komplekse kondensasie met positief gelaaide polipeptiede soos tau.Afhangende van die affiniteit van αS vir polikatione en die tempo van valensie-uitputting van die stollingsnetwerk, ondergaan klonte vinnige gelering of samevloeiing gevolg deur stadige amiloïedaggregasie.Deur 'n reeks gevorderde biofisiese tegnieke te kombineer, kon ons die vloeistof-vloeistof αS/Tau faseskeiding karakteriseer en die sleutelfaktore identifiseer wat lei tot die vorming van heterogene aggregate wat beide proteïene in 'n vloeibare proteïenkondensaat bevat.
Benewens membraankompartemente, kan ruimtelike skeiding in selle ook bereik word deur die vorming van proteïenryke, vloeistofagtige digte liggame wat biomolekulêre kondensate of druppels genoem word, deur 'n proses bekend as vloeistof-vloeistoffaseskeiding (LLPS).Hierdie druppels word gevorm deur multivalente tydelike interaksies, gewoonlik tussen proteïene of proteïene en RNA, en dien 'n verskeidenheid funksies in byna alle lewende sisteme.'n Groot aantal LLP-bekwame proteïene vertoon reekse van lae kompleksiteit wat hoogs ongeordend van aard is en in die vorming van biomolekulêre kondensate3,4,5.Talle eksperimentele studies het die buigsame, dikwels ongeordende en multivalente aard van die proteïene waaruit hierdie vloeistofagtige kondensate bestaan ​​aan die lig gebring, alhoewel min bekend is oor die spesifieke molekulêre determinante wat die groei en rypwording van hierdie kondensate beheer tot 'n meer soliede staat..
Die nuwe data ondersteun die hipotese dat afwykende proteïengedrewe LLPS en transformasie van druppels in soliede strukture relevante sellulêre weë kan wees wat lei tot die vorming van onoplosbare toksiese aggregate wat dikwels kenmerke van degeneratiewe siektes is.Baie LLPS-geassosieerde intrinsiek versteurde proteïene (IDP's), dikwels hoogs gelaai en buigsaam, is lank reeds geassosieer met neurodegenerasie deur die proses van amyloïedaggregasie.Daar is veral getoon dat biomolekulêre IDP-kondensate soos FUS7 of TDP-438 of proteïene met groot lae kompleksiteitsdomeine soos hnRNPA19 verouder tot jelagtige of selfs vaste vorms deur 'n proses wat fluïdisering genoem word.samestelling.na vastefase-oorgang (LSPT) as 'n funksie van tyd of in reaksie op sekere post-translasionele modifikasies of patologies betekenisvolle mutasies1,7.
Nog 'n IDP wat met LLPS in vivo geassosieer word, is Tau, 'n mikrotubuli-geassosieerde versteurde proteïen waarvan die amiloïed-aggregasie by Alzheimer se siekte geïmpliseer is10 maar ook onlangs by Parkinson se siekte (PD) betrek is en ander sinaptiese kernproteïenopatiee 11, 12, 13 is verwant.Daar is getoon dat Tau spontaan dissosieer van oplossing/sitoplasma as gevolg van gunstige elektrostatiese interaksies14, wat lei tot die vorming van tau-verrykte druppels bekend as elektrostatiese koacervate.Daar is ook waargeneem dat hierdie tipe nie-spesifieke interaksie die dryfkrag agter baie biomolekulêre kondensate in die natuur is15.In die geval van 'n tau-proteïen, kan elektrostatiese aggregasie gevorm word deur eenvoudige aggregasie, waarin teenoorgesteld gelaaide streke van die proteïen die splitsingsproses aanwakker, of deur komplekse aggregasie deur interaksie met negatief gelaaide polimere soos RNA.
Onlangs is α-sinuklein (αS), 'n amiloïed IDP wat betrokke is by PD en ander neurodegeneratiewe siektes wat gesamentlik bekend staan ​​as sinukleinopatie17,18, gedemonstreer in sellulêre en dieremodelle19,20 gekonsentreer in proteïenkondensate met vloeistofagtige gedrag.In vitro studies het getoon dat αS LLPS ondergaan deur eenvoudige aggregasie deur oorwegend hidrofobiese interaksies, alhoewel hierdie proses buitengewone hoë proteïenkonsentrasies en atipies lang inkubasietye vereis19,21.Of die αS-bevattende kondensate wat in vivo waargeneem word deur hierdie of ander LLPS-prosesse gevorm word, bly 'n belangrike onopgeloste kwessie.Net so, alhoewel αS-amyloïed-aggregasie in neurone in PD en ander sinukleinopatieë waargeneem is, bly die presiese meganisme waardeur αS intrasellulêre amiloïed-aggregasie ondergaan onduidelik, aangesien ooruitdrukking van hierdie proteïen blykbaar nie hierdie proses op sigself veroorsaak nie.Bykomende sellulêre skade word dikwels vereis, wat daarop dui dat sekere sellulêre liggings of mikro-omgewings nodig is vir die hernukleasie van intrasellulêre αS-amyloïedsamestellings.Een sellulêre omgewing wat veral geneig is tot aggregasie kan die binnekant van proteïenkondensate 23 wees.
Interessant genoeg is gevind dat αS en tau mede-lokaliseer in kenmerkende siekte-insluitings by mense met Parkinson se siekte en ander sinukleinopatiee 24,25 en eksperimente het 'n sinergistiese patologiese verwantskap tussen die twee proteïene 26,27 gerapporteer wat 'n potensiële verwantskap tussen aggregasie αS en tau in neurodegeneratiewe siektes.siekte.Daar is gevind dat αS en tau mekaar se aggregasie in vitro en in vivo 28,29 in wisselwerking en bevorder en heterogene aggregate wat uit hierdie twee proteïene saamgestel is, is waargeneem in die brein van pasiënte met sinukleinopatiee 30 .Min is egter bekend oor die molekulêre basis van die interaksie tussen αS en tau en die meganisme van die ko-aggregasie daarvan.Daar is gerapporteer dat αS met tau in wisselwerking tree deur 'n elektrostatiese aantrekking tussen die hoogs negatief gelaaide C-terminale gebied van αS en die sentrale prolienryke gebied van tau, wat ook verryk is in positief gelaaide residue.
In hierdie studie wys ons dat αS inderdaad in druppels kan dissosieer via elektrostatiese komplekse kondensasie in die teenwoordigheid van tau-proteïen, in teenstelling met sy interaksie met ander positief gelaaide polipeptiede soos poli-L-lisien (pLK), en in hierdie proses.αS dien as 'n steiermolekule vir die druppelnetwerk.Ons het merkbare verskille in die proses van rypwording van elektrostatiese αS-koaservate geïdentifiseer, wat geassosieer word met verskille in die valensie en sterkte van die interaksie van proteïene wat by die koaservatnetwerk betrokke is.Interessant genoeg het ons mede-aggregasie van αS- en tau-amyloïedproteïene in langlewende vloeibare koacervate waargeneem en 'n paar sleutelfaktore geïdentifiseer wat lei tot mede-aggregasie van hierdie twee proteïene in sulke koacervate.Hier beskryf ons in detail hierdie proses, wat 'n moontlike molekulêre meganisme is wat onderliggend is aan die kolokalisering van twee proteïene in siekte-spesifieke insluitings.
αS het 'n hoogs anioniese C-terminale stert by neutrale pH (Fig. 1a), en ons het veronderstel dat dit LLPS kan ondergaan deur die kondensasie van elektrostatiese komplekse met polikationiese wanordelike polipeptiedmolekules.Ons het 'n 100-residu poli-L-lisien (pLK) as die beginmodelmolekule gebruik as gevolg van sy positief gelaaide en wanordelike polimeriese aard by neutrale pH 32. Eerstens het ons bevestig dat pLK in wisselwerking met die Ct-domein van αS is deur middel van oplossing KMR-spektroskopie (Figuur 1b) met behulp van 13C/15N-gemerkte αS in die teenwoordigheid van toenemende αS:pLK molêre verhoudings.Die interaksie van pLK met die Ct-domein van αS manifesteer hom in versteurings van die chemiese verskuiwing en 'n afname in die piekintensiteit in hierdie area van die proteïen.Interessant genoeg, toe ons αS met pLK gemeng het teen 'n αS-konsentrasie van ongeveer.5–25 µM in die teenwoordigheid van poliëtileenglikol (5–15% PEG-8) (tipiese LLPS-buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) het ons dadelik deur 'n wye veld van proteïenvorming gegaan .druppels is waargeneem met behulp van fluoressensie (WF) en helderveld (BF) mikroskopie (Fig. 1c).1-5 µm druppels wat gekonsentreerde αS bevat (bygevoeg 1 µM AlexaFluor488-gemerkte αS, AF488-αS), hul elektrostatiese eienskappe kan afgelei word van hul weerstand teen 10% 1,6-heksaandiol (1,6-HD) en die sensitiwiteit daarvan vir 'n toename in NaCl-konsentrasie (Fig. 1c).Die vloeistofagtige aard van die koacervate van die αS/pLK elektrostatiese kompleks word gedemonstreer deur hul vermoë om binne millisekondes te versmelt (Fig. 1d).Met behulp van turbidimetrie het ons die vorming van druppels onder hierdie toestande gekwantifiseer, die elektrostatiese aard van die hoofinteraksie wat met sy stabiliteit geassosieer word, bevestig (Fig. 1e), en die effek van verskeie polimeerverhoudings op die LLPS-proses geëvalueer (Fig. 1f).Alhoewel druppelvorming oor 'n wye reeks polimeerverhoudings waargeneem word, is die proses baie gunstig wanneer pLK meer as αS is.LLP's is ook waargeneem met behulp van die chemies verskillende verdringingsmiddel dextran-70 (70 kDa) of met behulp van 'n verskeidenheid monsterformate, insluitend glasskyfiedruppels, mikroplaatputte van verskillende materiale, Eppendorf- of kwarts-kapillêre.
'n Skematiese voorstelling van verskillende proteïenstreke in die WT-αS en ΔCt-αS variante wat in hierdie studie gebruik is.Die amfipatiese N-terminale domein, die hidrofobiese amiloïedvormende (NAC) gebied en die negatief gelaaide C-terminale domein word onderskeidelik in blou, oranje en rooi getoon.Die Netto Charge Per Residual (NCPR) kaart van WT-αS word gewys.b KMR-analise van die αS/pLK-interaksie in die afwesigheid van makromolekulêre klonte.Soos pLK konsentrasie toeneem (aS:pLK molverhoudings van 1:0.5, 1:1.5 en 1:10 word onderskeidelik in liggroen, groen en donkergroen getoon).c Koacerveer αS/pLK (molverhouding 1:10) by 25 µM (1 µM AF488-gemerkte αS of Atto647N-gemerkte pLK vir WF-beelding) in LLPS-buffer (bo) of aangevul met 500 mM NaCl (links onder) of na 10 % 1,6-heksaandiol (1,6-HD; regs onder).Skaalstaaf = 20 µm.d Verteenwoordigende mikroskopiese beelde van BF druppelsamesmelting van αS/pLK (molêre verhouding 1:10) by 'n konsentrasie van 25 μM;pyle dui die samevoeging van individuele druppels (rooi en geel pyle) in 'n nuwe druppel (oranje pyl) binne 200 ms aan).Skaalstaaf = 20 µm.e Ligverstrooiing (by 350 nm) αS/pLK-aggregasie in LLPS-buffer voor en na byvoeging van 500 mM NaCl of 10% 1,6-HD by 25 µM αS (N = 3 monsterherhalings, gemiddelde en standaardafwyking ook aangedui).f BF-beeld (bo) en ligverstrooiingsanalise (by 350 nm, onder) van αS/pLK-aggregasie by 25 μM αS met toenemende αS:pLK-molêre verhouding (N = 3 monsterherhalings, gemiddelde en standaardafwyking ook aangedui).Skaalstaaf = 10 µm.Die skaalbalk op een prent dui die skaal van alle prente in een paneel aan.Rou data word verskaf in die vorm van rou data lêers.
Gebaseer op ons waarnemings van αS/pLK elektrostatiese komplekse kondensasie en vorige waarnemings van αS as 'n kliëntmolekule van die tau/RNA-kondensaat deur direkte interaksie met tau31, het ons veronderstel dat αS en tau saam met die oplosmiddel kan segregeer in die afwesigheid van RNA kondensasie.deur elektrostatiese komplekse, en αS is die steierproteïen in αS/Tau-koaservate (sien tau-ladingverspreiding in Figuur 2e).Ons het waargeneem dat wanneer 10 μM αS en 10 μM Tau441 (wat onderskeidelik 1 μM AF488-αS en 1 μM Atto647N-Tau bevat) in LLPS-buffer gemeng is, hulle maklik proteïenaggregate gevorm het wat beide proteïene bevat, soos gesien deur WF-mikroskopie.(Fig. 2a).Die kolokalisering van die twee proteïene in die druppels is bevestig deur konfokale (CF) mikroskopie (Aanvullende Fig. 1a).Soortgelyke gedrag is waargeneem wanneer dextran-70 as 'n samevoegingsmiddel gebruik is (Aanvullende Fig. 1c).Met behulp van óf FITC-gemerkte PEG of dextran, het ons gevind dat beide crowding agents eweredig oor die monsters versprei is, wat nóg segregasie nóg assosiasie toon (Aanvullende Fig. 1d).Dit dui eerder daarop dat hulle in hierdie stelsel faseskeiding bevorder deur makromolekulêre sametrekkingseffekte, aangesien PEG 'n voorkeur-stabiele sametrekkingsmiddel is, soos gesien in ander LLP-stelsels33,34.Hierdie proteïenryke druppels was sensitief vir NaCl (1 M), maar nie vir 1,6-HD (10% v/v), wat hul elektrostatiese eienskappe bevestig (Aanvullende Fig. 2a, b).Hulle vloeistof gedrag is bevestig deur die waarneming van millisekonde samesmelting druppel gebeure met behulp van BF mikroskopie (Fig. 2b).
'n Konfokale (CF) mikroskopiebeelde van αS/Tau441 koacervate in LLPS-buffer (10 μM van elke proteïen, 0.5 μM van AF488-gemerkte αS en Atto647N-gemerkte Tau441).b Verteenwoordigende differensiële interferensie kontras (DIC) beelde van αS/Tau441 druppel samesmelting gebeure (10 μM vir elke proteïen).c Fasediagram gebaseer op ligverstrooiing (by 350 nm) van Tau441 LLPS (0–15 µM) in die afwesigheid (links) of teenwoordigheid (regs) van 50 µM αS.Warmer kleure dui op meer verstrooiing.d Ligverstrooiing van αS/Tau441 LLPS-monsters met toenemende αS-konsentrasie (Tau441 by 5 µM, N = 2–3 monsterherhalings soos aangedui).e Skematiese voorstelling van sommige tau-proteïenvariante en verskillende streke van die proteïen wat in hierdie studie gebruik is: negatief gelaaide N-terminale domein (rooi), prolienryke gebied (blou), mikrotubuli-bindende domein (MTBD, uitgelig in oranje), en amiloïedvormende paarspiraal.filamentstreke (PHF) geleë binne die MTBD (grys).Die Netto Charge Per Residue (NCPR) kaart van Tau441 word gewys.f Gebruik 1 µM AF488-gemerkte αS en Atto647N-gemerkte ΔNt-, gebruik 1 µM AF488-gemerkte αS of ΔCt-αS in die teenwoordigheid van ΔNt-Tau (bo, 10 µM per proteïen) of K150 proteïen (onderkant) ) ) ) mikrograwe van WF gekondenseer in LLPS of K18 buffer.Die skaalstawe in een beeld verteenwoordig die skaal van alle beelde in een paneel (20 µm vir panele a, b en f).Rou data vir panele c en d word as rou datalêers verskaf.
Om die rol van αS in hierdie LLPS-proses te toets, het ons eers die effek van αS op druppelstabiliteit ondersoek deur nefelometrie deur toenemende konsentrasies van NaCl te gebruik (Fig. 2c).Hoe hoër die soutkonsentrasie in die monsters wat αS bevat, hoe hoër is die ligverstrooiingswaardes (by 350 nm), wat die stabiliserende rol van αS in hierdie LLPS-stelsel aandui.'n Soortgelyke effek kan waargeneem word deur die αS-konsentrasie (en dus die αS:Tau441-verhouding) tot ongeveer.10-voudige toename relatief tot die tau-konsentrasie (5 µM) (Fig. 2d).Om te demonstreer dat αS 'n steierproteïen in koacervate is, het ons besluit om die gedrag van die LLPS-ontwrigte Tau-mutant te ondersoek, wat nie 'n negatief gelaaide N-terminale streek (residu 1-150, sien Fig. 2e) genaamd ΔNt-Tau het nie.WF mikroskopie en nefelometrie het bevestig dat ΔNt-Tau self nie LLPS ondergaan het nie (Fig. 2f en Aanvullende Fig. 2d), soos voorheen berig 14. Toe αS egter by dispersie-oplossings van hierdie afgeknotte Tau-variant gevoeg is, was die LLPS-proses heeltemal herstel met druppeldigtheid naby aan die druppeldigtheid van volgrootte oplossings van Tau en αS onder soortgelyke toestande en proteïenkonsentrasies.Hierdie proses kan ook waargeneem word onder toestande van lae makromolekulêre ophoping (Aanvullende Fig. 2c).Die rol van die C-terminale αS-streek, maar nie die hele lengte daarvan nie, in die LLPS-proses is gedemonstreer deur inhibisie van druppelvorming deur gebruik te maak van 'n C-terminale afgeknotte αS-variant wat oorblyfsels 104-140 (Fig. 1a) van die (ΔCt-) ontbreek. αS) proteïen (Fig. 2f en Aanvullende Fig. 2d).Die kolokalisering van αS en ΔNt-Tau is bevestig deur konfokale fluoressensiemikroskopie (Aanvullende Fig. 1b).
Om die LLPS-meganisme tussen Tau441 en αS verder te toets, is 'n bykomende Tau-variant gebruik, naamlik die gepaarde heliese filamentkern (PHF) fragment in die mikrotubule-bindingsdomein (MTBD), wat as dit vier kenmerkende herhalende domeine bevat, algemeen ook bekend as die K18-fragment (sien Fig. 2e).Daar is onlangs gerapporteer dat αS verkieslik bind aan 'n tau-proteïen wat in 'n prolienryke domein geleë is in 'n volgorde wat die mikrotubuli-bindende domein voorafgaan.Die PHF-streek is egter ook ryk aan positief gelaaide residue (sien Figuur 2e), veral lisien (15% residue), wat ons aangespoor het om te toets of hierdie streek ook bydra tot die kondensasie van die αS/Tau-kompleks.Ons het waargeneem dat K18 alleen nie LLPS kon aktiveer by konsentrasies tot 100 μM onder die toestande wat getoets is (LLPS buffer met 15% PEG of 20% dektraan) (Figuur 2f).Toe ons egter 50 µM αS by 50 µM K18 gevoeg het, is vinnige vorming van proteïendruppels wat K18 en αS bevat, waargeneem deur nefelometrie (Aanvullende Fig. 2d) en WF-mikroskopie (Fig. 2f).Soos verwag, was ΔCt-αS nie in staat om die LLPS-gedrag van K18 te herstel nie (Fig. 2f).Ons let daarop dat αS/K18-aggregasie effens hoër proteïenkonsentrasies vereis om LLPS te induseer in vergelyking met αS/ΔNt-Tau of αS/Tau441, terwyl ander dinge gelyk is.Dit stem ooreen met 'n sterker interaksie van die αS C-terminale streek met die prolienryke Tau-domein in vergelyking met die mikrotubuli-bindende domein, soos voorheen beskryf 31 .
Aangesien ΔNt-Tau nie LLPS in die afwesigheid van αS kan uitvoer nie, het ons hierdie Tau-variant gekies as 'n model vir die karakterisering van αS/Tau LLPS gegewe die eenvoud daarvan in LLPS-stelsels met vollengte Tau (isotipe, Tau441/Tau441).met komplekse (heterotipiese, αS/Tau441) aggregasieprosesse.Ons het die mate van αS-aggregasie (as deel van die gekondenseerde fase-proteïen, fαS,c) in die αS/Tau- en αS/ΔNt-Tau-stelsels vergelyk deur sentrifugering en verspreide fase SDS-PAGE-analise (sien 2e), het baie soortgelyke waardes gevind. vir alle proteïene in dieselfde konsentrasie.Ons het veral fαS,c 84 ± 2% en 79 ± 7% vir αS/Tau en αS/ΔNt-Tau onderskeidelik verkry, wat daarop dui dat die heterotipiese interaksie tussen αS en tau beter is as die interaksie tussen tau-molekules.tussen.
Die interaksie met verskeie polikatione en die effek van die kondensasieproses op die αS kinetika is eers bestudeer deur die fluoressensie herstel na fotobleiking (FRAP) metode.Ons het αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau en αS/pLK koaservate getoets (100 μM αS aangevul met 2 μM αS AF488-αS en 100 μM Tau441 of ΔNt-Tau of 1 mM pLK).Data is verkry binne die eerste 30 minute nadat die monsterkomponente gemeng is.Van verteenwoordigende FRAP-beelde (Fig. 3a, αS/Tau441-kondensasie) en hul ooreenstemmende tydverloopkurwes (Fig. 3b, Aanvullende Fig. 3), kan gesien word dat αS-kinetika baie soortgelyk is aan dié van Tau441-koaservate.en ΔNt-Tau, wat baie vinniger is met pLK.Die berekende diffusiekoëffisiënte vir αS binne-in die koaservaat volgens FRAP (soos beskryf deur Kang et al. 35) is D = 0.013 ± 0.009 µm2/s en D = 0.026 ± 0.008 µm2/s vir αS/TauS/ΔN αS/Tau441 en die αS/-stelsel.pLK, Tau en D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, onderskeidelik (Fig. 3c).Die diffusiekoëffisiënt αS in die gedispergeerde fase is egter verskeie ordes van grootte hoër as alle gekondenseerde fases, soos bepaal deur Fluoresensie Korrelasie Spektroskopie (FCS, sien Aanvullende Fig. 3) onder dieselfde toestande (LLPS buffer) maar in die afwesigheid van polikatione (D = 8 ± 4 µm2/s).Daarom is die kinetika van αS-translasie aansienlik verminder in koaservate in vergelyking met proteïene in die gedispergeerde fase as gevolg van uitgesproke molekulêre sametrekkingseffekte, alhoewel alle koaservate vloeistofagtige eienskappe behou gedurende die eerste halfuur na hul vorming, in teenstelling met die tau-fase.vinniger kinetika in pLK kondensaat.
a–c FRAP-analise van αS-dinamika (2% AF488-gemerkte αS) in elektrostatiese koaservate.Verteenwoordigende beelde van αS/Tau441 FRAP-toetse in drievoud word in (a) getoon, waar rooi sirkels ontkleurde areas aandui.Die skaalbalk is 5 µm.b Gemiddelde FRAP-krommes en (c) berekende diffusiekoëffisiënte (D) vir 5–6 (N) verskillende druppels uit drie eksperimente met 100 µM αS en ekwimolêre konsentrasies van Tau441 (rooi) of ΔNt-Tau (blou) of pLK (groen) teen tien keer die konsentrasie van LLPS.Die standaardafwyking van die FRAP-kromme word in geskakeerde kleur getoon.Ter vergelyking is die diffusiekoëffisiënt αS in die verspreide fase in drievoud bepaal deur gebruik te maak van fluoressensie-korrelasiespektroskopie (FCS) (sien Aanvullende Figuur 3 en metodes vir meer inligting).d Kontinue X-band EPR spektra van 100 μM TEMPOL-122-αS in LLPS buffer sonder enige polikation (swart) of in die teenwoordigheid van 100 μM Tau441 (rooi) of ΔNt-Tau (blou) of 1 mM pLK (groen).Die insetsel toon 'n vergrote aansig van die sterk veldlyne waar die mees dramatiese veranderinge plaasvind.e Bindingskurwes van 50 μM TEMPOL-122-αS met verskeie polikatione in die afwesigheid van LLPS (geen PEG).Die verminderde amplitude van band III in vergelyking met band II (IIII/III) van die genormaliseerde EPR-spektrum word getoon om die molêre verhoudings van Tau441 (rooi), ΔNt-Tau (blou) en pLK (groen) te verhoog.Gekleurde lyne wys passing by data deur gebruik te maak van 'n rowwe bindingsmodel met n identiese en onafhanklike bindingsplekke op elke kurwe.Rou data word verskaf in die vorm van rou data lêers.
As 'n aanvulling het ons die dinamika van αS in verskeie koaservate ondersoek deur gebruik te maak van gerigte spin-etikettering (SDSL) en deurlopende elektron paramagnetiese resonansie (CW-EPR).Hierdie metode het bewys dat dit baie nuttig is om die buigsaamheid en dinamika van die GOP te rapporteer met 'n realistiese residuele resolusie36,37,38.Vir hierdie doel het ons sisteïenreste in enkele Cys-mutante gekonstrueer en die 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametielpiperidine-N-oksiel (TEMPOL) spinsonde gebruik.Maleïmied afgeleides benoem hulle.Meer spesifiek, ons het TEMPOL-probes by posisie 122 of 24 αS (TEMPOL-122-αS en TEMPOL-24-αS) ingevoeg.In die eerste geval teiken ons die C-terminale gebied van die proteïen, wat betrokke is by interaksie met polikatione.In plaas daarvan kan posisie 24 vir ons inligting gee oor die algehele dinamika van die proteïene in die kondensaat.In beide gevalle het die EPR-seine wat vir proteïene van die gedispergeerde fase verkry is, ooreengestem met nitroksiedradikale in die vinnig bewegende toestand.Na faseskeiding in die teenwoordigheid van tau of pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 of ΔNt-Tau teen 'n verhouding van 1:1 of pLK teen 'n verhouding van 1:10), is 'n toename in die relatiewe piekintensiteit waargeneem in die EPR-spektrum van αS.Die verlieslyn het verbreed, wat verminderde αS-heroriëntasiekinetika in druppels aandui in vergelyking met proteïen in verdunde fase (Fig. 3d, Aanvullende Fig. 4a).Hierdie veranderinge is meer uitgesproke by posisie 122. Terwyl by posisie 24 die teenwoordigheid van pLK nie die kinetika van die sonde beïnvloed het nie, het by posisie 122 die spektrale lynvorm aansienlik verander (Aanvullende Fig. 4a).Toe ons probeer het om die spektra by posisie 122 van twee αS/polikasiestelsels te modelleer met behulp van die isotropiese model (Aanvullende Figuur 5a) wat algemeen gebruik word om die dinamika van spin-gemerkte IDP38,39 te beskryf, was ons nie in staat om die eksperimentele spektra te rekonstrueer nie..Spektrale simulasie van die posisie van 24 spin kontraste (Aanvullende Fig. 5a).Dit dui daarop dat daar voorkeurposisies is in die spasie van spinkonfigurasies van die C-terminale streek van αS in die teenwoordigheid van polikatione.Wanneer die fraksie van αS in die gekondenseerde fase onder eksperimentele EPR-toestande oorweeg word (84 ± 2%, 79 ± 7% en 47 ± 4% vir onderskeidelik αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau en αS/pLK—sien Aanvullende Fig. 2e van data-analise c), kan dit gesien word dat die verbreding wat deur die EPR-metode opgespoor word hoofsaaklik die interaksie van die C-terminale streek van αS met verskeie polikatione in die gekondenseerde fase weerspieël (die belangrikste verandering by die gebruik van TEMPOL-122- αS), en nie proteïenkondensasie nie.'n Toename in mikroviskositeit word in die sonde waargeneem.Soos verwag, is die EPR-spektrum van die proteïen onder ander toestande as LLPS heeltemal herstel toe 1 M NaCl by die mengsel gevoeg is (Aanvullende Fig. 4b).Oor die algemeen dui ons data daarop dat die veranderinge wat deur CW-EPR opgespoor word hoofsaaklik die interaksie van die C-terminale streek van αS met verskeie polikatione in die gekondenseerde fase weerspieël, en hierdie interaksie blyk sterker te wees met pLK as met Tau.
Om meer strukturele inligting oor die proteïene in die koaservaat te verkry, het ons besluit om die LLPS-stelsel te bestudeer deur KMR in oplossing te gebruik.Ons kon egter slegs die αS-fraksie wat in die verspreide fase oorbly, opspoor, wat moontlik te wyte is aan verminderde proteïendinamika binne die koaservaat en 'n digte fase aan die onderkant van die oplossing in KMR-analise.Toe ons die struktuur en dinamika van die proteïen wat in die verspreide fase van die LLPS-monster oorbly met behulp van KMR (Aanvullende Fig. 5c, d) ontleed het, het ons opgemerk dat die proteïen amper identies gedra in die teenwoordigheid van pLK en ΔNt-Tau, beide van wat in sekondêre struktuur en dinamika van die proteïenruggraat was, aan die lig gebring deur eksperimente op sekondêre chemiese verskuiwing en R1ρ ontspanning.KMR-data toon dat die C-terminus van αS 'n beduidende verlies aan konformasie-buigsaamheid ly terwyl dit sy wanordelike aard behou, soos die res van die proteïenvolgorde, as gevolg van sy interaksies met polikatione.
Aangesien die CW-EPR seinverbreding wat in die TEMPOL-122-αS gekondenseerde fase waargeneem is, die interaksie van die proteïen met polikatione weerspieël, het ons 'n EPR titrasie uitgevoer om die bindingsaffiniteit van αS aan verskeie polikatione te evalueer in die afwesigheid van LLPS (geen akkumulasie van Buffer LLPS), wat daarop dui dat die interaksies dieselfde is in verdunde en gekonsentreerde fases (wat bevestig word deur ons data, Aanvullende Fig. 4a en Aanvullende Fig. 6).Die doel was om te sien of alle koacervate, ten spyte van hul algemene vloeistofagtige eienskappe, enige onderliggende differensiële gedrag op molekulêre vlak toon.Soos verwag, het die EPR-spektrum verbreed met toenemende polikationkonsentrasie, wat 'n afname in molekulêre buigsaamheid weerspieël as gevolg van molekulêre interaksies van alle interaksievennote byna tot versadiging (Fig. 3e, Aanvullende Fig. 6).pLK het hierdie versadiging bereik teen 'n laer molêre verhouding (polikation:αS) in vergelyking met ΔNt-Tau en Tau441.Trouens, vergelyking van die data met 'n benaderde bindingsmodel wat n identiese en onafhanklike bindingsplekke aanneem, het getoon dat die skynbare dissosiasiekonstante van pLK (~5 μM) 'n orde van grootte laer is as dié van Tau441 of ΔNt-Tau (~50 μM) ).µM).Alhoewel dit 'n rowwe skatting is, dui dit daarop dat αS 'n hoër affiniteit het vir eenvoudiger polikations met kontinue positiewe ladingstreke.Gegewe hierdie verskil in affiniteit tussen αS en verskeie polikatione, het ons veronderstel dat hul vloeibare eienskappe verskillend met verloop van tyd kan verander en dus aan verskillende LSPT-prosesse ly.
Gegewe die hoogs oorvol omgewing binne die proteïen-koaservaat en die amyloïed-aard van die proteïen, het ons die gedrag van die koaservaat oor tyd waargeneem om moontlike LSPT-prosesse op te spoor.Deur gebruik te maak van BF- en CF-mikroskopie (Figuur 4), het ons waargeneem dat αS/Tau441 tot 'n groot mate in oplossing saamwerk en groot druppels vorm wat die oppervlak aan die onderkant van die put/gly as vol druppels kontak en natmaak, soos verwag is (Aanvullende Fig. .7d);ons noem hierdie onder-gevormde strukture "proteïenvlotte".Hierdie strukture het vloeibaar gebly aangesien hulle die vermoë behou het om te versmelt (Aanvullende Fig. 7b) en kon gesien word vir etlike ure nadat LLPS geaktiveer is (Figuur 4 en Aanvullende Fig. 7c).Ons het waargeneem dat die benattingsproses bevoordeel word op die oppervlak van hidrofiele eerder as hidrofobiese materiale (Aanvullende Fig. 7a), soos verwag word vir elektrostatiese koacervate met ongebalanseerde ladings en dus hoë elektrostatiese oppervlakpotensiale.Veral, αS/ΔNt-Tau-samesmelting en vlotvaart is aansienlik verminder, terwyl αS/pLK-kondensate aansienlik verminder is (Fig. 4).Gedurende die kort inkubasietyd kon die αS/pLK druppels saamsmelt en die hidrofiele oppervlak benat, maar hierdie proses het vinnig gestop en na 5 ure se inkubasie is slegs beperkte samevloeiingsgebeure en geen benatting waargeneem nie.– gel-drup-oorgang.
Verteenwoordigende BF (grysskaalpanele) en CF (regterpanele, AF488-gemerkte αS in groen) van koaservaatmonsters wat 100 µM αS (1% fluoresserende etiket) in LLPS-buffer bevat in die teenwoordigheid van 100 µM Tau441 (boonste) fluoressensie ΔN mikroskopiese beelde -Tau (middel) of 1 mM pLK (onder) by verskillende inkubasietye en brandpunthoogtes (z, afstand vanaf die onderkant van die plaatput).Die eksperimente is 4-6 keer herhaal onafhanklik van mekaar met dieselfde resultate.αS/Tau441-koaservate word na 24 uur benat, wat vlotte groter as die beeld vorm.Die skaalbalk vir alle beelde is 20 µm.
Ons het toe gevra of die groot vloeistofagtige proteïenpoele wat in αS/Tau441 LLPS gevorm word, sal lei tot amyloïedaggregasie van enige van die proteïene wat bestudeer is.Ons het die rypwording van αS/Tau441-druppels oor tyd met WF-mikroskopie gevolg onder dieselfde toestande as hierbo, maar met behulp van 1 μM AF488-gemerkte αS en Atto647N-gemerkte Tau441 (Fig. 5a).Soos verwag, het ons volledige proteïenlokalisering deur die rypwordingsproses waargeneem.Interessant genoeg, vanaf ca.Na 5 uur is meer intense nie-sirkelvormige strukture binne die vlotte waargeneem, wat ons "punte" genoem het, waarvan sommige met αS gekolokaliseer is, en sommige in Tau441 verryk is (Fig. 5a, wit pyle).Hierdie kolle is nog altyd in 'n groter mate binne vlotte waargeneem vir αS/ΔNt-Tau as vir αS/ΔNt-Tau.Daar was geen duidelike kolle in die druppels van pLK- en Tau-stelsels wat onbevoeg was vir samesmelting/benatting nie.Om te toets of hierdie vlekke wat αS en Tau441 bevat amyloïed-agtige aggregate is, het ons 'n soortgelyke eksperiment uitgevoer met behulp van CF mikroskopie waarin Tau441 gemerk is met Atto647N en 12.5 μM amyloïed-spesifieke thioflavien-T (ThT) is van die begin af bygevoeg.kleurstof.Alhoewel ThT-kleuring van αS/Tau441 druppels of vlotte nie waargeneem is nie, selfs na 24 uur se inkubasie (Fig. 5b, boonste ry-oorblywende druppels oor proteïenvlotte), was ThT-positiewe strukture wat Atto647N-Tau441 in die vlotte bevat het, baie swak.dit herhaal die grootte, vorm en ligging van die voorheen beskryfde kolle (Fig. 5b, middelste en onderste rye), wat daarop dui dat die kolle kan ooreenstem met amiloïedagtige aggregate wat in verouderende vloeistofkoaservate gevorm word.
WF 25 μM αS by verskeie inkubasietye en brandpunthoogtes (z, afstand vanaf ongebonde bodem) in die teenwoordigheid van 25 μM Tau441 (1 μM AF488-gemerkte αS en Atto647N-gemerkte Tau441) in 'n put van 'n mikroskoopplaat met LLPS buffer) .Ses eksperimente is onafhanklik herhaal met soortgelyke resultate.b CF mikroskopiese beeld van 25 μM αS in die teenwoordigheid van 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-gemerk Tau441) en 12.5 μM thioflavien-T (ThT).Geweegde proteïendruppels en gedeponeerde proteïenvlotte en kolle word onderskeidelik in die boonste en middelste rye getoon.Die onderste ry toon beelde van vlotte en druppels van 3 onafhanklike herhalings.Wit pyle dui ThT-positiewe kolletjies in beide panele aan.Die skaalbalk vir alle beelde is 20 µm.
Om die veranderinge in die koacervate-proteïennetwerk tydens die oorgang van vloeistof na vaste stof in meer besonderhede te ondersoek, het ons fluoressensie-leeftydbeelding (FLIM) en Förster-resonansie-energie-oordragmikroskopie (FRET) (Figuur 6 en Aanvullende Figure 8 en 9) gebruik.Ons het veronderstel dat die samevoeging van rypwording van die laag tot 'n meer gekondenseerde of selfs soliede geaggregeerde proteïenstruktuur lei tot nouer kontak tussen die proteïen en die fluoresserende sonde wat daaraan geheg is, wat moontlik 'n bluseffek kan produseer wat in 'n verkorte sondeleeftyd (τ) gemanifesteer word. , soos voorheen beskryf40.,41 ,42.Daarbenewens, vir dubbel-gemerkte monsters (AF488 en Atto647N as onderskeidelik FRET skenker en aanvaarder kleurstowwe), kan hierdie afname in τ ook gepaard gaan met koacervate kondensasie en 'n toename in FRET(E) doeltreffendheid tydens LSPT.Ons het vlot- en kolvorming oor tyd gemonitor in LLPS αS/Tau441 en αS/ΔNt-Tau monsters (25 µM van elke proteïen in LLPS buffer wat 1 µM AF488 gemerk αS en/of Atto647N gemerk Tau441 of ΔNt-Tau bevat).Ons het 'n algemene neiging waargeneem deurdat die fluoressensieleeftyd van die AF488 (τ488) en Atto647N (τ647N) probes effens afgeneem het soos die koacervate verouder het (Fig. 6 en Aanvullende Fig. 8c).Interessant genoeg is hierdie verandering aansienlik verbeter vir kolletjies binne vlotte (Fig. 6c), wat aandui dat verdere proteïenkondensasie by kolletjies plaasgevind het.Ter ondersteuning hiervan is geen beduidende verandering in fluoressensieleeftyd waargeneem vir αS/ΔNt-Tau-druppels wat vir 24 uur verouder is nie (Aanvullende Fig. 8d), wat daarop dui dat druppelgelering 'n proses is wat verskil van vlekvorming en wat nie met beduidende molekulêre herorganisasie gepaardgaan nie. binne koacervate.Daar moet kennis geneem word dat die kolletjies verskillende groottes en veranderlike inhoud in αS het, veral vir die αS/Tau441-stelsel (Aanvullende Fig. 8e).Die afname in kolfluoressensieleeftyd het gepaard gegaan met 'n toename in intensiteit, veral vir Atto647N gemerk Tau441 (Aanvullende Fig. 8a), en hoër FRET doeltreffendheid vir beide αS/Tau441 en αS/ΔNt-Tau stelsels, wat verdere kondensasie in LLPS Vyf uur aandui. na sneller het die proteïene binne die statiese elektrisiteit gekondenseer.In vergelyking met αS/ΔNt-Tau, het ons laer τ647N en ietwat hoër τ488 waardes waargeneem in αS/Tau441 kolle, vergesel van laer en meer onhomogene FRET waardes.Moontlik kan dit verband hou met die feit dat in die αS/Tau441-stelsel, die waargenome en verwagte αS-oorvloed in aggregate meer heterogeen is, dikwels substoïgiometries in vergelyking met Tau, aangesien Tau441 self ook LLPS en aggregasie kan ondergaan (Aanvullende Fig. 8e). .Die mate van druppelsamesmelting, vlotvorming en, belangriker, proteïenaggregasie binne vloeistofagtige koaservate is egter maksimaal wanneer beide Tau441 en αS teenwoordig is.
'n Lewenslange fluoressensiemikroskopie (FLIM) beelde van αS/Tau441 en αS/ΔNt-Tau by 25 μM van elke proteïen (1 μM AF488-gemerkte αS en 1 μM Atto647N-gemerkte Tau441 of ΔNt PS-Tau) buffer.Die kolomme toon verteenwoordigende beelde van LLPS-monsters op verskillende rypwordingstye (30 min, 5 uur en 24 uur).Die rooi raam wys die streek wat αS/Tau441 kolle bevat.Lewensduur word as kleurstawe getoon.Skaalbalk = 20 µm vir alle beelde.b Ingezoomde FLIM-beeld van die geselekteerde area, getoon in die rooi blokkie in paneel a.Lewensreekse word getoon deur dieselfde kleurskaal as in paneel a te gebruik.Skaalstaaf = 5 µm.c Histogramme wat AF488 (geheg aan αS) of Atto647N (geheg aan Tau) toon vir verskillende proteïenspesies (druppels-D-, vlot-R- en spikkel-P) geïdentifiseer in FLIM-beelde aangeteken vir αS-) tydsberekeningverspreidings leeftyd van Tau441 en αS/ΔNt-Tau coacerveer monsters (N = 17-32 ROI vir D, 29-44 ROI vir R, en 21-51 ROI vir punte).Gemiddelde en mediaanwaardes word onderskeidelik as geel vierkante en swart lyne binne blokkies getoon.Die onderste en boonste grense van die blokkie verteenwoordig die eerste en derde kwartiele, onderskeidelik, en die minimum en maksimum waardes binne die 1,5-voudige interkwartielreeks (IQR) word as snorbaarde getoon.Uitskieters word as swart diamante getoon.Statistiese betekenisvolheid tussen pare verdelings is bepaal deur gebruik te maak van 'n twee-steekproef t-toets, met die veronderstelling van ongelyke variansies.Tweekantige t-toets p-waardes word getoon met sterretjies vir elke paar vergelykende data (* p-waarde > 0.01, ** p-waarde > 0.001, *** p-waarde > 0.0001, **** p-waarde > 0,00001), ns Dui weglaatbaarheid aan (p-waarde > 0,05).Die presiese p-waardes word in aanvullende tabel 1 gegee, en die oorspronklike data word as rou datalêers aangebied.
Om die amyloïedagtige aard van spikkels/aggregate verder te demonstreer, het ons ongekleurde koaservate monsters vir 24 uur behandel met hoë konsentrasies van (1 M) NaCl, wat gelei het tot die skeiding van aggregate van proteïen koaservate.Wanneer geïsoleerde aggregate (dws 'n gedispergeerde oplossing van aggregate) met behulp van atoomkragmikroskopie (AFM) waargeneem is, het ons 'n oorwegend sferiese morfologie met 'n gereelde hoogte van ongeveer 15 nm waargeneem, wat geneig is om te assosieer onder toestande van hoë soutkonsentrasie, soortgelyk aan die gedrag van tipiese amiloïed fibrille as gevolg van die sterk hidrofobiese effek op die oppervlak (let op dat fibrille tipies 'n hoogte van ~10 nm het) (Aanvullende Fig. 10a).Interessant genoeg, toe geïsoleerde aggregate in 'n standaard ThT-fluoressensietoets met ThT geïnkubeer is, het ons 'n dramatiese toename in ThT-fluoressensie-kwantumopbrengs waargeneem, vergelykbaar met dié wat waargeneem is wanneer die kleurstof met tipiese αS-amyloïedfibrille geïnkubeer is (Aanvullende Fig. 10b), wat daarop dui dat die koaservaat-aggregate bevat amyloïedagtige strukture..Trouens, die aggregate was verdraagsaam teen hoë soutkonsentrasies maar sensitief vir 4 M guanidienchloried (GdnHCl), soos tipiese amiloïed fibrille (Aanvullende Fig. 10c).
Vervolgens het ons die samestelling van die aggregate ontleed deur gebruik te maak van enkelmolekule fluoressensie, spesifieke fluoressensie korrelasie/kruiskorrelasie spektroskopie (FCS/FCCS), en bars analise van twee-kleur toevalsopsporing (TCCD).Vir hierdie doel het ons aggregate geïsoleer wat na 24 uur se inkubasie gevorm is in 100 μl LLPS-monsters wat αS en Tau441 bevat (albei 25 μM) saam met 1 μM AF488-gemerkte αS en 1 μM Atto647N-gemerkte Tau4411.Verdun die resulterende gedispergeerde aggregaatoplossing tot 'n monomolekulêre toestand met dieselfde PEG-vrye buffer en 1 M NaCl (dieselfde buffer wat gebruik word om aggregate van koaservaat te skei) om enige moontlike elektrostatiese interaksies tussen LLPS en proteïen te voorkom.'n Voorbeeld van die tydtrajek van 'n enkele molekule kan in Fig. 7a gesien word.FCCS/FCS-analise (kruiskorrelasie, CC en outokorrelasie, AC) het getoon dat aggregate wat αS en tau bevat volop in die monsters was (sien CC-kromme in Fig. 7b, linkerpaneel), en 'n oormaat oorblywende monomeriese proteïen het ontstaan ​​as 'n resultaat van die verdunningsproses (sien WS-krommes in Figuur 7b, linkerpaneel).Kontrole-eksperimente wat onder dieselfde oplossingstoestande uitgevoer is met behulp van monsters wat slegs monomeriese proteïene bevat het, het geen CC-krommes getoon nie, en die AC-krommes pas goed by die een-komponent diffusiemodel (Vgl. 4), waar monomeriese proteïene die verwagte diffusiekoëffisiënte het (Fig. 7b) ), regterpaneel).Die diffusiekoëffisiënt van geaggregeerde deeltjies is minder as 1 µm2/s, en dié van monomeriese proteïene is ongeveer 1 µm2/s.50–100 µm/s;waardes is soortgelyk aan voorheen gepubliseerde waardes vir gesonikeerde αS amyloïde fibrille en monomeriese αS afsonderlik onder soortgelyke oplossingstoestande44.Toe ons die aggregate met TCCD-ontploffingsanalise (Fig. 7c, boonste paneel) ontleed het, het ons gevind dat in elke geïsoleerde aggregaat (αS/Tau heteroaggregate), ongeveer 60% van die opgespoorde aggregate beide αS en tau bevat het, ongeveer 30% slegs bevat tau, slegs ongeveer 10% αS.Stoïgiometriese analise van αS/Tau heteroaggregate het getoon dat die meeste van die heteroaggregate in tau verryk is (stoïgiometrie onder 0.5, die gemiddelde aantal tau-molekules per aggregaat is 4 keer meer as αS-molekules), wat ooreenstem met ons werk wat in FLIM in situ waargeneem is. eksperimente..FRET-analise het getoon dat hierdie aggregate beide proteïene bevat het, hoewel die werklike FRET-waardes in hierdie geval nie van groot belang is nie, aangesien die verspreiding van fluorofore in elke aggregaat ewekansig was as gevolg van 'n oormaat ongemerkte proteïen wat in die eksperiment gebruik is.Interessant genoeg, toe ons dieselfde analise uitgevoer het met behulp van die 45,46 volwasse amiloïed-aggregasie-tekort Tau-variant (sien Aanvullende Fig. 11a,b), het ons opgemerk dat alhoewel die αS elektrostatiese aggregasie dieselfde was (Aanvullende Fig. 11c, d), die vermoë om aggregate binne die koaservaat te vorm is drasties verminder en FLIM het verskeie kolle in in situ eksperimente opgespoor, en swak kruis-korrelasie kurwes is waargeneem vir geïsoleerde aggregaat monsters.Vir 'n klein aantal opgespoorde aggregate (slegs een tiende van Tau441), het ons egter waargeneem dat elke aggregaat verryk was in αS as hierdie Tau-variant, met ongeveer 50% van die bespeurde aggregate wat slegs αS-molekules bevat, en αS was in oormaat heterogeen .aggregate (sien Aanvullende Fig. 11e), in teenstelling met die heterogene aggregate wat deur Tau441 gegenereer word (Fig. 6f).Die resultate van hierdie eksperimente het getoon dat alhoewel αS self in staat is om te akkumuleer met tau binne die koacervaat, is tau-kernvorming gunstiger onder hierdie toestande, en die gevolglike amiloïedagtige aggregate is in staat om as 'n vorm van αS en tau op te tree.Sodra 'n tau-ryke kern egter gevorm is, word heterotipiese interaksies tussen αS en tau in aggregate bevoordeel bo homotipiese interaksies tussen tau-molekules;ons neem ook proteïennetwerke waar in vloeibare αS/tau-koaservate.
a Verteenwoordigende fluoressensie temporale spore van enkele molekules van geïsoleerde aggregate gevorm in αS/Tau441 elektrostatiese koaservate.Uitbarstings wat ooreenstem met αS/Tau441 koaggregate (sarsies bo die aangeduide drempel) is waargeneem in drie opsporingskanale (AF488 en Atto647N emissie na direkte opwekking, blou en rooi lyne, Atto647N emissie na indirekte opwekking), FRET, violetlyn).b FCS/FCCS-analise van 'n monster van geïsoleerde αS/Tau441-aggregate verkry vanaf LLPS (linkerpaneel).Outokorrelasie (AC) kurwes vir AF488 en Atto647N word onderskeidelik in blou en rooi getoon, en kruiskorrelasie (CC) kurwes geassosieer met aggregate wat beide kleurstowwe bevat word in pers getoon.Die AC-krommes weerspieël die teenwoordigheid van gemerkte monomeriese en geaggregeerde proteïenspesies, terwyl die CC-kurwes slegs die diffusie van dubbel-gemerkte aggregate toon.Dieselfde analise, maar onder dieselfde oplossingstoestande as in geïsoleerde kolle, word monsters wat slegs monomeriese αS en Tau441 bevat, as kontroles in die regterpaneel getoon.c Fluoresensie-flitsanalise van enkelmolekules van geïsoleerde aggregate gevorm in αS/Tau441 elektrostatiese koaservate.Inligting vir elke aggregaat wat in vier verskillende herhalings gevind word (N = 152) word geplot teen hul stoïgiometrie, S-waardes en FRET-doeltreffendheid (boonste paneel, kleurbalk weerspieël voorkoms).Drie tipes aggregate kan onderskei word: -αS-alleen aggregate met S~1 en FRET~0, Tau-alleen aggregate met S~0 en FRET~1, en heterogene Tau/αS aggregate met intermediêre S en FRET Skattings van die hoeveelheid van beide merkerproteïene wat in elke heterogene aggregaat (N = 100) opgespoor is, word in die onderste paneel getoon (die kleurskaal weerspieël die voorkoms).Rou data word verskaf in die vorm van rou data lêers.
Die rypwording of veroudering van vloeibare proteïenkondensate in jelagtige of soliede strukture met verloop van tyd is gerapporteer om betrokke te wees by verskeie fisiologiese funksies van die kondensaat47 sowel as by siekte, as 'n abnormale proses wat amyloïedaggregasie voorafgaan 7, 48, 49. Hier ons bestudeer faseskeiding en gedrag in detail.LSPT αS in die teenwoordigheid van ewekansige polikatione in 'n beheerde omgewing teen lae mikromolêre konsentrasies en fisiologies relevante toestande (let op dat die berekende fisiologiese konsentrasie van αS >1 µM50 is), na aanleiding van tipiese termodinamies-gedrewe gedrag van LPS.Ons het gevind dat αS, wat 'n hoogs negatief gelaaide C-terminale gebied by fisiologiese pH bevat, in staat is om proteïenryke druppels in waterige oplossing via LLPS te vorm in die teenwoordigheid van hoogs kationiese versteurde peptiede soos pLK of Tau deur die proses van elektrostatiese komplekse kondensasie in die teenwoordigheid van aggregasie makromolekules.Hierdie proses kan relevante effekte hê in die sellulêre omgewing waar αS verskeie polikationiese molekules teëkom wat verband hou met sy siekte-geassosieerde aggregasie beide in vitro en in vivo51,52,53,54.
In baie studies is proteïendinamika binne druppels beskou as een van die sleutelfaktore wat die rypwordingsproses bepaal55,56.In elektrostatiese αS-koaservate met polikatione hang die rypwordingsproses klaarblyklik af van die sterkte van interaksies met polikatione, die valensie en die veelheid van hierdie interaksies.Ewewigsteorie stel voor dat 'n ewewigslandskap van twee vloeibare toestande die teenwoordigheid van 'n groot druppel ryk aan biopolimere sal wees wat LLPS57,58 aandryf.Druppelgroei kan bereik word deur Ostwald-rypwording59, samesmelting60 of verbruik van vrye monomeer in die gedispergeerde fase61.Vir αS en Tau441, ΔNt-Tau of pLK, is die meeste van die proteïen in die kondensaat gekonsentreer onder die toestande wat in hierdie studie gebruik is.Alhoewel volgrootte tau-druppels vinnig saamgesmelt het tydens oppervlakbenatting, was druppelsamesmelting en benatting moeilik vir ΔNt-Tau en pLK, wat 'n vinnige verlies aan vloeistof-eienskappe in hierdie twee stelsels voorstel.Volgens ons FLIM-FRET-analise het die verouderde pLK- en ΔNt-Tau-druppels 'n soortgelyke mate van proteïenaggregasie (soortgelyke fluoressensieleeftyd) as die oorspronklike druppels getoon, wat daarop dui dat die oorspronklike proteïennetwerk behou is, alhoewel meer rigied.
Ons rasionaliseer ons eksperimentele resultate in die volgende model (Figuur 8).Die aanvanklik tydelik gevormde druppels is dikwels proteïennetwerke sonder elektrostatiese kompensasie, en dus is daar areas van ladingwanbalans, veral by die druppelgrensvlak, wat druppels met 'n hoë elektrostatiese oppervlakpotensiaal tot gevolg het.Om te kompenseer vir lading ('n verskynsel wat algemeen na verwys word as valensie-uitputting) en die oppervlakpotensiaal van die druppels te minimaliseer, kan die druppels nuwe polipeptiede van die verdunde fase insluit, proteïennetwerke herorganiseer om lading-lading-interaksies te optimaliseer, en met ander druppels interaksie te hê.met oppervlaktes (benatting).Die αS/pLK-druppels, as gevolg van hul eenvoudiger proteïennetwerk (slegs heterotipiese interaksies tussen αS en pLK) en groter affiniteit vir proteïen-proteïen-interaksies, blyk in staat te wees om die lading van die kondensaat vinniger te balanseer;inderdaad, ons het vinniger proteïenkinetika waargeneem in aanvanklik gevormde αS/pLK-koaservate as in αS/Tau.Na valensie-uitputting word die interaksies minder kortstondig en die druppels verloor hul vloeistof eienskappe en verander in jelagtige, nie-vlambare druppels met 'n lae elektrostatiese oppervlakpotensiaal (en dus nie in staat om die oppervlak nat te maak nie).Daarteenoor is αS/Tau-druppels minder doeltreffend om druppelladingsbalans te optimaliseer as gevolg van meer komplekse proteïennetwerke (met beide homotipiese en heterotipiese interaksies) en die swakker aard van proteïeninteraksies.Dit lei tot druppels wat vloeistofgedrag vir lang tydperke behou en 'n hoë elektrostatiese oppervlakpotensiaal toon wat geneig is om geminimaliseer te word deur saam te voeg en te groei (dus die oppervlakarea/volume verhouding van die druppels tot die minimum te beperk) en deur die hidrofiele oppervlakchemikalie te benat.Dit skep groot gekonsentreerde proteïenbiblioteke wat vloeibare eienskappe behou aangesien die interaksies baie verbygaande bly as gevolg van die konstante soeke na ladingoptimering in die proteïennetwerk.Interessant genoeg vertoon N-terminaal afgeknotte vorms van Tau, insluitend sommige natuurlik voorkomende isovorme62, intermediêre gedrag, met sommige koaservate wat met αS verouder tot langlewende jelagtige druppels, terwyl ander in groot vloeibare kondensate verander.Hierdie dualiteit in die rypwording van αS elektrostatiese koaservate stem ooreen met onlangse LLPS teoretiese en eksperimentele studies wat 'n korrelasie tussen valensie-uitputting en elektrostatiese sif in kondensate geïdentifiseer het as 'n sleutel tot die beheer van kondensaatgrootte en vloeistof eienskappe.Meganisme 58.61.
Hierdie skema toon die vermeende amiloïed-aggregasie-weg vir αS en Tau441 via LLPS en LSPT.Met bykomende anioonryke (rooi) en katioonryke (blou) streke, het αS en tau elektrostatiese koaservate met bevredigende valensie laer oppervlakenergie en dus minder samesmelting, wat lei tot vinnige druppelveroudering.'n Stabiele nie-geagglomereerde jeltoestand word bereik..Hierdie situasie is baie gunstig in die geval van die αS/pLK stelsel as gevolg van sy hoër affiniteit en eenvoudiger proteïen-paar interaksie netwerk, wat voorsiening maak vir 'n vinnige gel-agtige oorgang.Inteendeel, druppels met onbevredigende valensie en dus proteïengelaaide gebiede wat vir interaksie beskikbaar is, maak dit makliker vir die koaservaat om die hidrofiele oppervlak te versmelt en nat te maak om die hoë oppervlak-energie daarvan te verminder.Hierdie situasie is verkieslik vir αS/Tau441 koaservate, wat 'n multivalente komplekse netwerk het wat bestaan ​​uit swak Tau-Tau en αS-Tau interaksies.Op hul beurt sal groter koaservate makliker hul vloeistofagtige eienskappe behou, wat ander proteïen-tot-proteïen-interaksies toelaat om te voorkom.Uiteindelik vorm amyloïed heterogene aggregate wat beide αS en tau bevat binne die koacervate vloeistof, wat verwant kan wees aan dié wat in insluitingsliggame voorkom, wat kenmerke is van neurodegeneratiewe siektes.
Die groot vloeistofagtige strukture wat gevorm word tydens rypwording van αS/Tau441 met 'n hoogs oorbelaste maar dinamiese proteïenomgewing en, tot 'n mindere mate, αS/ΔNt-Tau-koaservate is ideale reservoirs vir die kernvorming van proteïenaggregasie.Ons het inderdaad die vorming van vaste proteïenaggregate in hierdie tipe proteïenkoaservate waargeneem, wat dikwels beide αS en tau bevat.Ons het getoon dat hierdie heteroaggregate gestabiliseer word deur nie-elektrostatiese interaksies, in staat is om amyloïed-spesifieke ThT kleurstowwe te bind op dieselfde manier as tipiese amiloïde fibrille, en inderdaad soortgelyke weerstand teen verskeie invloede het.Daar is getoon dat die αS/tau-aggregate wat deur LLPS gevorm word, amiloïedagtige eienskappe het.Inderdaad, die volwasse variant van Tau wat gebrekkig is aan amiloïed-aggregasie is aansienlik benadeel in die vorming van hierdie heterogene αS-aggregate binne die vloeibare elektrostatiese koaservaat.Die vorming van αS/Tau441-aggregate is slegs binne die koaservate waargeneem, wat vloeistofagtige eienskappe behou het, en nooit, as die koaservate/druppels nie die geltoestand bereik het nie.In laasgenoemde geval verhoed die verhoogde sterkte van elektrostatiese interaksies en as gevolg daarvan die rigiditeit van die proteïennetwerk die nodige konformasie-herrangskikkings van proteïene om nuwe proteïeninteraksies te vestig wat nodig is vir amiloïedkernvorming.Dit kan egter bereik word in meer buigsame, vloeistofagtige koacervate, wat op hul beurt meer geneig is om vloeibaar te bly namate hulle groter word.
Die feit dat die vorming van aggregate binne die gekondenseerde fase verkieslik is in groot αS/Tau-kondensate as in klein druppels wat vinnig gel, beklemtoon die relevansie van die identifisering van die faktore wat druppelsamesmelting beheer.Daar is dus nie net 'n neiging tot faseskeiding nie, maar die grootte van die kondensaat moet beheer word vir behoorlike funksionering sowel as siektevoorkoming58,61.Ons resultate beklemtoon ook die belangrikheid van die balans tussen LLPS en LSPT vir die αS/Tau-stelsel.Terwyl druppelvorming teen amiloïed-aggregasie kan beskerm deur die hoeveelheid proteïenmonomere wat beskikbaar is onder versadigingstoestande te verminder, soos in ander stelsels voorgestel is63,64, kan druppelsamesmelting by hoë druppelvlakke lei tot interne proteïenaggregasie deur stadige konformasie-herrangskikkings.proteïen netwerke..
Oor die algemeen beklemtoon ons data sterk die relevansie van samehangende valensie en tevrede/onbevredigde interaksies in druppelnetwerke in die konteks van LSPT.In die besonder wys ons dat vollengte αS/Tau441-kondensate doeltreffend kan saamsmelt en kernvorm om amyloïedagtige heteroaggregate te vorm wat beide proteïene insluit en 'n molekulêre meganisme voorstel gebaseer op ons eksperimentele resultate.Die ko-aggregasie van twee proteïene in die αS/Tau-vloeistofkoaservaat wat ons hier rapporteer, kan inderdaad verband hou met die mede-lokalisering van twee proteïene in insluitings, wat kenmerke van die siekte is, en kan bydra tot die begrip van die verband tussen LLPS en amiloïed-aggregasie, wat die weg baan vir hoogs gelaaide IDP in neurodegenerasie.
Monomere WT-αS, sisteïenmutante (Q24C-αS, N122C-αS) en ΔCt-αS variante (Δ101-140) is in E. coli uitgedruk en gesuiwer soos voorheen beskryf.5 mM DTT is ingesluit in alle stappe in die suiwering van αS sisteïenmutante om disulfiedbindingsvorming te voorkom.Tau441-isovorm (plasmied verkry vanaf Addgene #16316), ΔNt-Tau-variant (Δ1–150, verkry deur IVA te kloneer met primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) en AggDef-2CTer-variant met EGGDef-1CT,5C-variant gesuiwer. coli-kulture was gegroei tot OD600 = 0.6-0.7 by 37°C en 180 rpm, en uitdrukking is geïnduseer met IPTG vir 3 uur by 37°C.Oes selle by 11 500 xg vir 15 min by 4 °C en was met soutbuffer wat 150 mM NaCl bevat.Hersuspendeer die korrel in lysisbuffer (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100).Die sonication stap is uitgevoer op ys met 'n amplitude van 80% vir 10 pulse (1 min aan, 1 min af).Moenie 60 ml in een ultraklank oorskry nie.E. coli-lisate is vir 20 minute by 95°C verhit, dan op ys afgekoel en vir 40 minute by 127 000×g gesentrifugeer.Die verhelderde supernatant is op 'n 3.5 kDa membraan (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, VK) toegedien en teen 4 L dialisebuffer (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM) , PMSF 0,1 mM) vir 10 uur.'n 5 ml katioonuitruilkolom (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, VSA) is met ekwilibrasiebuffer (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) geëquilibreer.Die taulisaat is deur 'n 0.22 μm PVDF filter gefiltreer en in die kolom ingespuit teen 'n vloeitempo van 1 ml/min.Eluering is geleidelik uitgevoer, tau is geëlueer met 15-30% elueringsbuffer (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Fraksies is deur SDS-PAGE ontleed, en enige fraksies wat een band bevat met die verwagte molekulêre gewig van tau is gekonsentreer met 'n 10 kDa sentrifugefilter en vervang met 'n buffer wat 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM en DTT 2 mM bevat vir die finale proteïenkonsentrasie was 100 μM.Die proteïenoplossing is dan deur 'n 0.22 μm PVDF-filter gevoer, vinnig gevries en by -80°C gestoor.Proteïen K18 is vriendelik verskaf deur prof. Alberto Boffi.Die suiwerheid van die preparaat was >95% soos bevestig deur SDS-PAGE en MALDI-TOF/TOF.Verskeie sisteïene is chemies gemerk met AlexaFluor488-maleimied (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, VSA) of TEMPOL-maleimied (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).is bevestig deur absorpsie en MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau en K18 is gemerk met inheemse sisteïenresidu op posisies 191 en 322 met behulp van Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Duitsland) volgens dieselfde prosedure.Netto lading per residu kaarte vir αS en Tau441 is gegenereer deur gebruik te maak van CIDER66.
Soliede poli-L-lisien (pLK DP 90-110 volgens NMR van verskaffer, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, VSA) is opgelos in 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 tot 10 mM konsentrasie, proses gesonikeer vir 5 minute in 'n ultrasoniese waterbad en stoor by -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, VSA) en FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, VSA) is wateroplosbaar en wydverspreid in LLPS-buffer.Dialise verwyder kontaminerende soute.Hulle is dan deur 'n spuitfilter met 'n poriegrootte van 0,22 μm gefiltreer, en hul konsentrasies is met behulp van 'n refraktometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, VSA) bereken.LLPS-monsters is in die volgende volgorde by kamertemperatuur voorberei: buffer en ekstrusie is gemeng en 1 mM tris(2-karboksietiel)fosfien (TCEP, Carbosynth, Compton, VK), 1 mM 2,2,2,2-(etaan- 1,2-diyldinitril) tetraasynsuur (EDTA, karboksinth) en 'n mengsel van 1% protease-inhibeerder (PMSF 100 mM, bensimied 1 mM, leupeptien 5 μM).Dan word αS en saamgesmelte polikatione (opsies pLK of Tau) bygevoeg.Vir thioflavien-T-tydreekseksperimente (ThT, Carbosynth, Compton, VK), gebruik die totale ThT-konsentrasie om die helfte van die αS-konsentrasie te wees.Meng die monsters sagkens maar deeglik om te verseker dat hulle homogeen is.Die konsentrasie van elke komponent het van eksperiment tot eksperiment gewissel, soos beskryf in die Resultate-afdeling.Asied is gebruik teen 'n konsentrasie van 0.02% (w/v) wanneer die duur van die eksperiment 4 uur oorskry het.Vir alle ontledings wat LLPS-monsters gebruik, laat die mengsel 5 minute lank ewewig word voor ontleding.Vir ligverstrooiingsanalise is 150 µl monsters op nie-bindende 96-put mikroplate (µClear®, swart, F-Bottom/Skoorsteenput, Greiner bio-one, Kremsmünster, Oostenryk) gelaai en met kleeffilm bedek.LLP's is gemonitor deur absorbansie by 350 nm by die middel van die oplossing in 'n CLARIOstar plaatleser (BMG Labtech, Ortenberg, Duitsland) te meet.Die eksperimente is in drievoud by 25°C uitgevoer, en die foute is as die standaardafwyking van die gemiddelde bereken.Die verdunde fase is gekwantifiseer deur monstersentrifugering en SDS-PAGE-gelanalise, en die αS-fraksie in die verdunde en gekonsentreerde fases is in verskeie LLPS-oplossings gekwantifiseer.'n 100 μl LLPS-monster wat 1 μM AF488-gemerkte αS bevat, is voorberei deur deeglike vermenging gevolg deur sentrifugering by 9600×g vir 30 minute, waarna die neerslag gewoonlik sigbaar was.Die boonste 50 μl van die supernatant is gebruik vir proteïen kwantifisering deur gebruik te maak van SDS-PAGE gel.Gele is geskandeer met AF488-filters met behulp van 'n ChemiDoc-gelbeeldstelsel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, VSA) of met Coomassie-kleur gekleur en met toepaslike filters gevisualiseer.Die gevolglike bande is ontleed met behulp van ImageJ weergawe 1.53i (National Institutes of Health, VSA).Die eksperimente is in duplikaat uitgevoer in twee verskillende eksperimente met soortgelyke resultate.
Tipies is 150 μl monsters op nie-bindende 96-put mikroplate toegedien en by kamertemperatuur op 'n Leica DMI6000B omgekeerde mikroskoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland) gevisualiseer.Vir koleksperimente is µ-Slide Angiogenesis plate (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Duitsland) of 96-put polistireen mikroplate (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ook gebruik.EL6000-halogeen- of kwikmetaalhaliedlampe is as beligtingsbronne gebruik (onderskeidelik vir BF/DIC- en WF-beelding).Vir WF-mikroskopie is 'n 40x-vergroting lugobjektief (Leica Microsystems, Duitsland) gebruik om die lig op die monster te fokus en dit te versamel.Vir AF488 en ThT gemerkte monsters, filter opwekking en emissie met standaard GFP filter stelle, opwekking en emissie banddeurlaat filters, onderskeidelik 460–500 nm en 512–542 nm banddeurlaat filters, en 'n 495 nm dichroïese spieël.Vir monsters gemerk met Atto647N, is 'n standaard stel Cy5 filters met opwekking en emissie banddeurlaat filters 628–40 nm en 692–40 nm, onderskeidelik, en 'n 660 nm dichroïese spieël gebruik.Vir BF- en DIC-mikroskopie, gebruik dieselfde gereflekteerde ligversamelingsdoelwit.Die versamelde lig is op 'n Leica DFC7000 CCD-kamera (Leica Microsystems, Duitsland) opgeneem.Die blootstellingstyd was 50 ms vir BF en DIC mikroskopie beelding en 20-100 ms vir WF mikroskopie beelding.Ter vergelyking was die blootstellingstyd vir alle eksperimente met ThT 100 ms.Tydverloop-eksperimente is uitgevoer om druppelsamesmelting te visualiseer, met beelde wat elke 100 ms vir etlike minute versamel is.ImageJ (NIH, VSA) is vir beeldanalise gebruik.Die eksperimente is in drievoud uitgevoer met soortgelyke resultate.
Vir kolokalisering eksperimente, FRAP en 3D rekonstruksie, is beelde verkry op 'n Zeiss LSM 880 omgekeerde konfokale mikroskoop met behulp van 'n ZEN 2 blou uitgawe (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Duitsland).Monsters van 50 µl is toegedien op µ-Slide Angiogenesis Petri-skottels (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Duitsland), behandel met 'n hidrofiele polimeer (ibiTreat) en gemonteer in 'n 63× olie-onderdompelingsdoelwit (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) op DIC).Beelde is verkry met behulp van 458 nm, 488 nm en 633 nm argon laserlyne met 'n resolusie van 0.26 µm/pixel en 'n blootstellingstyd van 8 µs/pixel vir opwekking en emissie-opsporingsvensters van 470–600 nm, 493–628 nm, 628 nm. en 638–755 nm is gebruik om onderskeidelik ThT, AF488 en Atto647N te visualiseer.Vir die FRAP-eksperimente is tydsverloopfotografie van elke monster teen 1 raam per sekonde opgeneem.Die eksperimente is in drievoud by kamertemperatuur uitgevoer met soortgelyke resultate.Alle beelde is ontleed met behulp van Zen 2 blou uitgawe sagteware (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Duitsland).Die FRAP-kurwes is genormaliseer, geplot en aangepas op intensiteit/tyddata wat uit beelde onttrek is met Zen 2 met OriginPro 9.1.Die herstelkrommes is gepas op 'n mono-eksponensiële model om vir molekulêre diffusie rekening te hou met 'n addisionele eksponensiële term om rekening te hou met die verkryging bleik effek.Ons het toe D bereken deur gebruik te maak van die nominale bleikradius en die voorheen vasgestelde herstelhalfleeftyd soos in die vergelyking van Kang et al.5 35 gewys.
Enkel sisteïenvariante van αS is gesintetiseer met 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametielpiperidine-N-oksiel (TEMPOL) op posisies 24 (TEMPOL-24-αS) en 122 (TEMPOL-122-αS), onderskeidelik.Spin-etikettering Vir EPR-eksperimente is die αS-konsentrasie op 100 μM gestel en die PEG-konsentrasie was 15% (w/v).Vir verskeie samevoegingstoestande was die αS:pLK verhouding 1:10, terwyl die αS:ΔNt-Tau en αS:Tau441 verhoudings op 1:1 gehandhaaf is.Vir bindingstitrasie-eksperimente in die afwesigheid van druk, is TEMPOL-122-αS op 50 μM gehandhaaf en polikatione is teen toenemende konsentrasies getitreer, wat elke toestand afsonderlik voorberei het.CW-EPR metings is uitgevoer met behulp van 'n Bruker ELEXSYS E580 X-band spektrometer toegerus met 'n Bruker ER4118 SPT-N1 resonator wat teen 'n mikrogolf (SHF) frekwensie van ~9.7 GHz werk.Die temperatuur is op 25°C gestel en deur 'n vloeibare stikstofkriostaat beheer.Die spektra is verkry onder onversadigde toestande teen 'n MW drywing van 4 mW, 'n modulasie amplitude van 0.1 mT, en 'n modulasie frekwensie van 100 kHz.Spektrale intensiteite is genormaliseer om verskille in spinkonsentrasies tussen monsters en moontlike spinreduksie te vermy as gevolg van residuele konsentrasies van reduseermiddels in monsters wat Tau441 of ΔNt-Tau (teenwoordig in die oorspronklike proteïenoplossings) bevat.Die gegewe waardes van g is verkry as gevolg van EPR-spektrale modellering wat uitgevoer is met behulp van die Easyspin-sagteware (v. 6.0.0-dev.34) wat in Matlab®67 geïmplementeer is.Een/twee komponent isotropiese modelle is gebruik om die data te modelleer.Nadat alle seine genormaliseer is, is die residue bereken deur elke simulasie van die ooreenstemmende eksperimentele spektrum af te trek.Vir bindingstitrasie-analise is die relatiewe intensiteit van die derde band tot die tweede band van die genormaliseerde EPR-spektrum (IIII/III) gebruik om die binding van polikatione aan αS te monitor.Om die dissosiasiekonstante (Kd) te skat, is die resulterende kurwe gepas by 'n benaderde model wat n identiese en onafhanklike bindingsplekke aanvaar.
KMR-spektroskopie-eksperimente is uitgevoer met behulp van 'n Bruker Neo 800 MHz (1H) KMR-spektrometer toegerus met 'n krioprobe en Z-gradiënt.Alle eksperimente is uitgevoer met behulp van 130-207 µM αS en ooreenstemmende αS/ΔNt-Tau en pLK ekwivalente in 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 en is uitgevoer by 15°C.Om LPS deur KMR te monitor, is 10% PEG by die voorafgemengde monsters gevoeg.Die chemiese verskuiwing versteuringsgrafiek (Fig. 1b) toon die gemiddelde 1H en 15N chemiese verskuiwings.Die αS 2D1H-15N HSQC-spektra is toegeken op grond van 'n vorige opdrag (BMRB-inskrywing #25227) en bevestig deur die 3D-spektra van HNCA, HNCO en CBCAcoNH op te teken en te ontleed.13Cα en 13Cβ chemiese verskuiwings is in die teenwoordigheid van ΔNt-Tau of pLK bereken om moontlike veranderinge in sekondêre struktuurneigings te meet in vergelyking met αS chemiese verskuiwings in suiwer ewekansige spoelkonformasie 68 (Aanvullende Figuur 5c).Die R1ρ-tempo's is gemeet deur hsqctretf3gpsi-eksperimente (verkry vanaf die Bruker-biblioteek) op te neem met vertragings van 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 en 800 ms, en die eksponensiële funksies is aangepas by die piek-vertragings keer om die R1ρ en sy eksperimentele onsekerheid te bepaal.
Twee-kleur tyd-opgeloste fluoressensie-mikroskopie-eksperimente is uitgevoer op 'n kommersiële tyd-opgeloste MT200 fluoressensie konfokale mikroskoop (PicoQuant, Berlyn, Duitsland) met 'n tyd-gekorreleerde enkelfoton telling (TCSPC) toestel.Die laserdiodekop word gebruik vir gepulseerde verweefde opwekking (PIE), die straal gaan deur 'n enkelmodusgolfleier en is ingestel op 'n laserkrag van 10 tot 100 nW vir 481 nm en 637 nm laserlyne gemeet na 'n dichroïese spieël.Dit verseker 'n optimale fotonteltempo, wat die effekte van fotonaliasing, fotobleiking en versadiging vermy.μ-Slide angiogenese dekstrokies of plate (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Duitsland) is direk in dompelwater geplaas oor 'n Super Apochromat 60x NA 1.2 lens met 'n korrektiewe kraag (Olympus Life Sciences, Waltham, VSA).’n 488/640 nm dichroïese spieël (Semrock, Lake Forest, IL, VSA) is as die hoofstraalverdeler gebruik.Ongefokusde bestraling word geblokkeer deur 'n gat met 'n deursnee van 50 mikron, dan word die gefokusde bestraling in 2 opsporingspaaie verdeel deur 'n 50/50 bundelverdeler.Banddeurlaat-emissiefilters (Semrock, Lake Forest, IL, VSA) 520/35 vir groen kleurstof (AF488) en 690/70 vir rooi kleurstof (Atto647N) is voor die detektor gebruik.Enkel-foton lawine diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italië) is as detektors gebruik.Beide data-insameling en -analise is uitgevoer met behulp van die kommersieel beskikbare SymphoTime64-sagteware (PicoQuant GmbH, Berlyn, Duitsland).
Vyftig mikroliter LLPS monsters is toegedien op μ-Slide angiogenese putte (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Duitsland).Die resulterende beelde is gefokus tot 20 µm bokant die putbodem vir optimale objektiewe werkafstand vir opgeskorte druppels en tot ~1 µm vir vlotte en kolletjies met 'n aksiale resolusie van ten minste 0.25 µm/pixel en 'n vertragingstyd van 400 µs/pixel.Kies data deur 'n intensiteitsdrempel toe te pas gebaseer op die gemiddelde agtergrondseinintensiteit (PBG, gemiddelde + 2σ) vir elke kanaal sodat slegs vloeibare proteïendruppels, vlotte of kolle gekies word, wat enige moontlike oorsprong uit die verspreide fase uitfiltreer.Om die lewensduur van elke spesie (τ) van elke kanaal (groen, "g" vir AF488 en rooi, "r" vir Atto647N) te ontleed, het ons streke van belang (ROI's) gekies wat druppels, vlotte of kolle bevat (Aanvullende Figuur 1) ).8b) en het dit afgelei deur hul leeftydverval (τD, τR en τP vir onderskeidelik druppels, vlotte of kolle, sien Aanvullende Fig. 8c) in elke kanaal te pas deur 'n stertpassing-analise en 'n twee-komponent-vervalmodel te gebruik.Gemiddeld τ vanaf τ .ROI's wat te min fotone geproduseer het vir 'n multi-eksponensiële passing is uitgesluit van die analise.Die afsnypunt wat gebruik is, was <104 fotone vir vlotte en kolletjies en 103 vir druppels.Die druppels het 'n laer drempel omdat dit moeilik is om vervalkurwes met hoër intensiteitwaardes te verkry, aangesien die druppels in die beeldveld gewoonlik kleiner en minder talryk is.ROI's met fotontellings bo die fotonakkumulasielimiet (gestel op >500 tellings/pixel) is ook vir analise weggegooi.Pas die intensiteitsvervalkromme verkry uit die streek van belang met 'n intensiteit by 90% van die maksimum (effens na die maksimum intensiteit van die verval) vanaf die begin van die dienslewe om minimale IRF-interferensie te verseker, terwyl dieselfde gehandhaaf word vir alle intensiteitsverval instellings Relatiewe tydvenster Is ontleed 25 tot 50 ROI vir vlotte en kolle en 15-25 ROI vir druppels, beelde gekies uit meer as 4 herhalings aangeteken van ten minste 3 onafhanklike eksperimente.Tweestert-t-toetse is gebruik om statistiese verskille tussen spesies of tussen koaservatstelsels te evalueer.Vir 'n pixel-vir-pixel-analise van die leeftyd (τ), is die totale verswakking van die leeftyd oor die veld vir elke kanaal bereken en 'n benadering van 'n 2/3-komponent eksponensiële verswakkingsmodel is uitgevoer.Die lewenslange verswakking vir elke pixel is dan gepas deur gebruik te maak van voorheen berekende τ waardes, wat gelei het tot 'n pseudokleur FLIM pas beeld.Die stertpas-leeftydreeks was dieselfde oor alle beelde van dieselfde kanaal, en elke verval het genoeg fotone geproduseer om 'n betroubare passing te verskaf.Vir FRET-analise is pixels gekies deur 'n laer intensiteitsdrempel van 100 fotone toe te pas, wat 'n agtergrondsein (FBG) van 11 fotone gemiddeld het.Die fluoressensie-intensiteit van elke kanaal is gekorrigeer deur eksperimenteel bepaalde korreksiefaktore: 69 spektrale oorspraak α was 0.004, direkte opwekking β was 0.0305, deteksie doeltreffendheid γ was 0.517.Die FRET-doeltreffendheid op die pixelvlak word dan bereken deur die volgende vergelyking te gebruik:
waar FDD die fluoressensie-intensiteit is wat in die skenker (groen) kanaal waargeneem word, FDA die fluoressensie-intensiteit is wat in die aanvaarder (rooi) kanaal waargeneem word onder indirekte opwekking, en FAA is die fluoressensie intensiteit wat in die aanvaarder (rooi) kanaal waargeneem word onder direkte opwekking ( PIE).Fluoresensie-intensiteitpulse word in die kanaal waargeneem).
Plaas 100 µl LLPS-reaksieoplossings wat 25 µM ongemerkte monomeriese Tau441 (met of sonder 25 µM αS) in LLPS-buffer (aangevul soos hierbo) op nie-bindende 96-put mikroplate met kleeffoeliebedekking en druppelvorming nagegaan is nadat dit deur WF mikroskopie gekontroleer is. ekwilibrasie.binne 10 min.Na 48 uur se inkubasie by kamertemperatuur, is die teenwoordigheid van proteïenvlotte en kolle bevestig.Verwyder dan die vloeistof versigtig oor die vlotte uit die putte, voeg dan 50 L dissosiasiebuffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) by en inkubeer vir 10 min.Die hoë soutkonsentrasie verseker dat LLPS nie sal herhaal as gevolg van oorblywende PEG nie, en moontlike proteïensamestellings wat slegs deur elektrostatiese interaksies gevorm word, sal uitmekaar gehaal word.Die bodem van die put is dan versigtig met 'n mikropipetpunt afgeskraap en die resulterende oplossing is na 'n leë waarnemingsput oorgeplaas.Na inkubasie van die monsters met 50 μM ThT vir 1 uur, is die teenwoordigheid van geïsoleerde kolle deur WF mikroskopie nagegaan.Berei sonikeerde αS fibrille voor deur 300 µl van 'n 70-µM αS-oplossing in PBS met pH 7.4, natriumasied 0.01% te inkubeer by 37 °C en 200 rpm op 'n orbitale skudder vir 7 dae.Die oplossing is dan vir 30 min by 9600×g gesentrifugeer, die korrel is hersuspendeer in PBS pH 7.4 en gesoniceer (1 min, 50% siklus, 80% amplitude in 'n Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, VSA) fibrilmonsters met 'n relatief eenvormige grootteverspreiding van klein fibrille.
FCS/FCCS analise en twee-kleur toevalsbespeuring (TCCD) is uitgevoer op dieselfde MT200 tyd-opgeloste fluoresserende konfokale mikroskoop (Pico-Quant, Berlyn, Duitsland) wat gebruik is vir die FLIM-FRET mikroskopie eksperimente met behulp van die PIE modus.Die laserkrag vir hierdie eksperimente is bygevoeg tot 6.0 µW (481 nm) en 6.2 µW (637 nm).Die kombinasie van hierdie laserkragte is gekies om soortgelyke helderheid te produseer vir die pare fluorofore wat gebruik word, terwyl optimale teltempo's bereik word en fotobleiking en versadiging vermy word.Beide data-insameling en -analise is uitgevoer met behulp van die kommersieel beskikbare SymphoTime64 weergawe 2.3 sagteware (PicoQuant, Berlyn, Duitsland).
Monsters van geïsoleerde αS/Tau-aggregate verkry met behulp van LLPS word in isolasiebuffer verdun tot die toepaslike monomolekulêre konsentrasie (tipies 'n 1:500-verdunning, aangesien aggregate reeds by lae konsentrasies is wanneer dit uit koacervaatmonsters geïsoleer word).Monsters is direk toegedien op dekstrokies (Corning, VSA) wat vooraf met 'n BSA-oplossing bedek is teen 'n konsentrasie van 1 mg/ml.
Vir die PIE-smFRET analise in die groen en rooi kanale, is 'n laer intensiteit drempel van 25 fotone toegepas om lae intensiteit seine wat veroorsaak word deur monomere gebeure uit te filter (let op dat monomere meer as geaggregeerde monsters is in vergelyking met geïsoleerde aggregate).Hierdie drempel is bereken as vyf keer die gemiddelde intensiteit van monomeriese αS verkry uit die ontleding van suiwer monomeermonsters om spesifiek aggregate vir analise te selekteer.Die PIE-dryfkring, tesame met TSCPC-data-verkryging, het die toepassing van 'n leeftydgewigfilter moontlik gemaak wat help om agtergrond en spektrale oorspraak uit te skakel.Die opvlamintensiteit gekies deur gebruik te maak van die bogenoemde drempels is gekorrigeer deur gebruik te maak van die gemiddelde agtergrondsein wat bepaal is vanaf die histogramme van voorkoms teenoor intensiteit/bak van die buffer-alleen monsters.Uitbarstings wat met groot aggregate geassosieer word, beslaan tipies verskeie opeenvolgende bakke in die tydspoor (gestel op 1 ms).In hierdie gevalle is 'n bak met maksimum sterkte gekies.Vir FRET en stoïgiometriese analise is die teoreties bepaalde gammafaktor γ (0.517) gebruik.Spektrale oorspraak en direkte opwekkingbydraes is weglaatbaar (eksperimenteel bepaal) by die opwekkingslaserkrag wat gebruik word.Die doeltreffendheid en stoïgiometrie van FRET in 'n ontploffing word soos volg bereken.