ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dupleks gelaste buis vir chemiese industrie chemiese komponent, 'n tekort aan SPECC1L lei tot verhoogde stabiliteit van gesplitste gewrigte en verminderde afskeiding van kraniale neurale kuifselle.

Dankie dat jy Nature.com besoek het.Jy gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).Daarbenewens, om deurlopende ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dupleks gelaste buis vir chemiese industrie

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.is ' n toonaangewende vervaardiger wat gespesialiseerde is in vlekvrye staal naatlose pype , helder uitgegloeide buise , naatlose opgerolde buise , ens .Ten einde kliënte te fasiliteer, ons het gesweis pype en buise ook.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.het die mees gevorderde vervaardiging en toets toerusting.Ons kan heeltemal aan jou vereiste voldoen.Volgens standaard baie streng, het buise wat deur ons vervaardig altyd korrekte OD en WT toleransie.Die toleransiebeheer is streng in ooreenstemming met die vervaardigingstandaarde.Ons produkte is altyd tevrede met kliënte.Kliënte wat ons produkte gekoop het, het meer winste geskep.
a) OD (buitendeursnee): 3,18 mm tot 101,6 mm
b) WT (Wanddikte): 0,5 mm tot 20 mm
c) Lengte: Volgens die kliënt se vereiste
d) Standaarde: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ens
e) Prosesmetode: ERW, EFW ens

Sliders wat drie artikels per skyfie wys.Gebruik die terug- en volgende-knoppies om deur die skyfies te beweeg, of die skyfiebeheerknoppies aan die einde om deur elke skyfie te beweeg.
Die kraniale neurale kuifselle (CNCC) gly van die embrioniese neurale voue af en migreer na die faringeale boë, wat die meeste van die middelvlakstrukture vorm.CNCC disfunksie speel 'n belangrike rol in die etiologie van orofasiale spleet, 'n algemene aangebore misvorming.Heterosigotiese SPECC1L mutasies is gevind in pasiënte met atipiese en sindiese splete.Hier rapporteer ons verbeterde kleuring van kanoniese adhesive junction (AJ) komponente, β-catenin en E-cadherin in gekweekte SPECC1L knockdown selle, en elektronmikrograwe toon apikale-basale diffusie van AJ.Om die rol van SPECC1L in kraniofasiale morfogenese te verstaan, het ons 'n Specc1l-defekte muismodel geskep.Homosigotiese mutante is embrionies dodelik en vertoon verswakte neuraalbuissluiting en CNCC-laminering.AJ-proteïenkleuring word verhoog in mutante neurale voue.Hierdie AJ-defek stem ooreen met 'n defek in CNCC-delaminering, wat AJ-ontbinding vereis.Daarbenewens het Specc11-mutante verminderde PI3K-AKT-sein en verhoogde apoptose.In vitro was ligte inhibisie van PI3K-AKT sein in wildtipe selle voldoende om AJ veranderinge te veroorsaak.Wat belangrik is, is dat AJ-veranderinge wat deur SPECC1L-afsakking veroorsaak word, omgekeer kan word deur die aktivering van die PI3K-AKT-weg.Saamgevat dui hierdie data daarop dat SPECC1L, as 'n nuwe reguleerder van PI3K-AKT-sein en AJ-biologie, nodig is vir neuraalbuissluiting en CNCC-stratifikasie.
Kraniale neurale kuifselle (CNCCs) lokaliseer na die dorsale neuroektoderm en los van die neuroepiteel van die ontwikkelende neurale voue deur 'n proses wat die epiteel-mesenchimale oorgang (EMT)1,2,3 behels.Premigrerende epiteel-CNCC's ontwrig intersellulêre aansluitings en word migrerende mesenchimale CNCC's wat die eerste en tweede faringeale boë vul en die meeste van die kraniofasiale kraakbeen vorm.Gene wat CNCC-funksie reguleer, word dus dikwels ontwrig in die etiologie van kraniofasiale aangebore anomalieë soos orofasiale splete, wat meestal 1/800 geboortes in die VSA alleen affekteer.Een van die aangebore misvormings8.
Delaminering van die CNCC val saam met die sluiting van die anterior neurale buis tussen 8.5 en 9.5 dae van embrioniese ontwikkeling in muise.Mutante van 'n aantal muis orofasiale spleet-geassosieerde gene vertoon ook een of ander vorm van neuraalbuisdefek, insluitend Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 en Pdgfrα12.Die prosesse van neuraalbuissluiting en CNCC-stratifikasie kan egter as onafhanklik beskou word, aangesien die Splotch-mutantmuis (Pax3) defekte in neuraalbuissluiting vertoon sonder enige effek op CNCC-stratifikasie of migrasie 13,14.Bykomende muismodelle met defekte in CNCC disseksie en neurale buis sluiting sal help om die gemeenskaplike molekulêre basis van hierdie twee prosesse af te baken.
Isolasie van CNCC van neuroepiteelselle vereis die ontbinding van adhesive junctions (AJ's), wat saamgestel is uit proteïenkomplekse wat onder andere E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin en α-aktinien wat met aktienfilamente 2 geassosieer word, bevat Ooruitdrukkingstudies E-cadherin in neurale voue het 'n vermindering of vertraging in CNCC-delaminering getoon.Omgekeerd lei onderdrukking van E-cadherin tot vroeë stratifikasie15,16.Baie van die faktore wat EMT tydens CNCC-stratifikasie bemiddel is transkripsiefaktore (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) en ekstrasellulêre matriks (ECM) hermodelleringsproteïene soos matriksmetalloproteïnases (MMP's), maar CNCCs is direkte sitoskeletale AJ-reguleerders nog nie bekend nie.Dit is bekend dat die PI3K-AKT-roete E-cadherin-vlakke teenwerk, hoofsaaklik van kankernavorsing17.Onlangse studies het getoon dat verlies van PDGFα-gebaseerde PI3K-AKT-sein in muise lei tot kraniofasiale abnormaliteite, insluitend gesplete verhemelte en neuraalbuisdefekte12.Die verband tussen die PI3K-AKT-weg en AJ-stabiliteit op CNCC-stratifikasie is egter onduidelik.
Ons het voorheen SPECC1L geïdentifiseer as die eerste mutante geen in twee mense met 'n ernstige spleet wat strek van die mond na die oog, bekend as oblique cleft (ObFC) of Tessier IV18 spleet.SPECC1L-mutasies is geïdentifiseer in twee multigenerasionele families met die outosomale dominante Opitz G/BBB-sindroom (OMIM #145410), waarin geaffekteerde individue hiperafstand en gesplete lip/verhemelte vertoon het19, en in een gesin met Tibi-oorafstandsindroom (OMIM #145420)20 .meer as die helfte van die gevalle van Opitz G/BBB-sindroom is X-gekoppel (OMIM #300000) en word veroorsaak deur mutasies in die MID1-geen, wat proteïen 22 van die mikrotubuli-geassosieerde selskelet kodeer.Ons veronderstel dat SPECC1L, ook 'n proteïen geassosieer met mikrotubuli en die aktien-sitoskelet, sein kan bemiddel wat nodig is vir aktien-sitoskelet-hermodellering tydens seladhesie en migrasie 18 .Deur in vitro en in vivo studies, beskryf ons nou SPECC1L as 'n nuwe reguleerder van AJ stabiliteit deur PI3K-AKT sein.Op die sellulêre vlak het SPECC1L-tekort 'n afname in die vlak van die pan-AKT-proteïen en 'n toename in die apikaal-basale verspreiding van AJ tot gevolg gehad, wat deur chemiese aktivering van die AKT-weg uitgeskakel is.In vivo toon Specc11-tekorte embrio's verswakte neurale buis sluiting en verminderde CNCC disseksie.Dus, SPECC1L funksioneer in hoogs gereguleerde sel adhesie-gebaseerde sein wat benodig word vir normale CNCC funksie tydens gesig morfogenese.
Om die rol van SPECC1L op sellulêre vlak te karakteriseer, het ons die voorheen beskryfde stabiele osteosarkoomsellyn U2OS-tekort in SPECC1L18 gebruik.Hierdie stabiele U2OS-selle met SPECC1L (kd) afslaan het 'n matige (60-70%) afname in die vlakke van SPECC1L transkripsies en proteïene gehad, tesame met defekte in migrasie en herorganisasie van die aktien sitoskelet 18. Daarteenoor, 'n ernstige verbygaande afname in Daar is getoon dat SPECC1L tot mitotiese defekte lei 23 .Na verdere karakterisering het ons gevind dat ons stabiele SPECC1L-kd selle morfologie verander het teen 'n baie hoë mate van samevloeiing (Figuur 1).Individuele kontroleselle en kd-selle by lae samevloeiing het soortgelyk gelyk (Figuur 1A,D).24 uur na samesmelting het kontroleselle hul kubusvorm behou (Fig. 1B, E), terwyl SPECC1L-kd-selle verleng het (Fig. 1C, F).Die omvang van hierdie verandering in selvorm is vasgevang deur in vivo lewendige beelding van kontroleselle en kd-selle (fliek 1).Om die rol van SPECC1L in samevloeiende selle te bepaal, het ons eers die uitdrukking daarvan ondersoek.Ons het gevind dat SPECC1L-proteïenvlakke toegeneem het met samesmelting (Figuur 1G), terwyl SPECC1L-transkripsievlakke nie toegeneem het nie (Figuur 1H).Daarbenewens, soos seldigtheid toegeneem het, het SPECC1L-proteïen by intersellulêre grense opgehoop (Fig. 2A-E), met 'n patroon wat oorvleuel met dié van membraan-geassosieerde β-catenin (Fig. 2A'-E').Gegewe die assosiasie van SPECC1L met die aktien-sitoskelet 18,23, het ons veronderstel dat SPECC1L interaksie het met aktien-gebaseerde kleefverbindings (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) selle verleng by hoë samevloeiing (F) in vergelyking met kontrole U2OS selle (AC).Hier word drie van die ses tydpunte (T1, T3, T6) getoon wat ons vir verskillende seldigthede gekies het.(G) Western klad analise wat toon dat die SPECC1L proteïen gestabiliseer word teen 'n hoë graad van samevloeiing in vergelyking met 'n lae graad van samevloeiing in kontroleselle.Western klad van SPECC1L toon die verwagte 120 kDa band en 'n hoër molekulêre gewig band, moontlik post-translasie gewysig (*).Western klad analise is uitgevoer onder dieselfde toestande vir lae en hoë samevloeiing.Beelde wat SPECC1L by lae en hoë samevloeiing toon, is van dieselfde klad geneem.Dieselfde klad is verwyder en weer ondersoek met β-aktien teenliggaampies.(H) Kwantitatiewe RT-PKR analise het geen betekenisvolle veranderinge in SPECC1L transkripsievlakke getoon nie.Foutstawe verteenwoordig SEM's van vier onafhanklike eksperimente.
(AE) Ons het ses tydpunte (T1-T6) gekies wat 'n reeks seldigthede verteenwoordig om selvormanalise en AJ-veranderinge in U2OS-selle te normaliseer met SPECC1L-afslaan (kd).Die eerste vyf van hierdie tydpunte het enkelselle (T1), 50-70% samesmelting van klein selgroepe (T2), samesmelting sonder hervorming van kd-selle (T3), hervorming van kd-selle (T4) en 24 uur-veranderinge ingesluit.in die posterior vorm van kd (T5) selle.Die SPECC1L-proteïen is oorwegend in die sitoplasma by T1 (A) versprei, maar die ophoping daarvan is by intersellulêre grense by daaropvolgende tydpunte (B-E, pyle) waargeneem.(FJ) β-katenien toon soortgelyke akkumulasie by intersellulêre grense wat met die AJ-kompleks geassosieer word.(A'-E') SPECC1L en β-catenin toon oorvleuelende kleuring by selgrense by hoë seldigtheid (pyle).(F'-J') In SPECC1L-kd-selle lyk β-katenienkleuring normaal teen lae seldigtheid (F'-H'), maar brei uit soos selvorm verander (I', J'; pyle), wat aandui dat AJ het verander.Stawe = 10 µm.
Ons het toe probeer om die effek van SPECC1L-tekort op AJ te bepaal.Ons het verskeie AJ-geassosieerde merkers gebruik, insluitend die kanoniese komponente F-aktien, miosien IIb, β-catenin en E-cadherin24,25,26,27.Aktin stres vesels het toegeneem in SPECC1L-kd selle soos voorheen beskryf (Fig. 3A, B) 18.Miosien IIb geassosieer met aktien filamente het 'n soortgelyke toename in SPECC1L-kd selle in vitro (Fig. 3C, D).AJ-geassosieerde β-catenin bind aan cadherin by die selmembraan, wat 'n normale "heuningkoek" uitdrukkingspatroon in kontrole kubosiete toon (Fig. 3E,G).Interessant genoeg, in plat beelde wat konfokale mikroskopie gebruik, het β-catenin (Fig. 3E,F) en E-cadherin (Fig. 3G,H) kleuring op die selmembraan van samevloeiende SPECC1L-tekorte selle prominente patrone van uitgebreide kleuring getoon.Hierdie uitbreiding van AJ-geassosieerde β-catenin-kleuring in kd-selle was die meeste uitgesproke by samevloeiing, maar het blykbaar veranderinge in selvorm voorafgegaan (Fig. 2F-J, F'-J').Om die fisiese aard van hierdie uitgebreide AJ-kleuring te bepaal, het ons selgrense op die apikale-basale oppervlak van SPECC1L-kd U2OS-selle ondersoek deur transmissie-elektronmikroskopie (TEM) (Figuur 3I, J).In teenstelling met kontroleselle (Fig. 3I), wat afsonderlike elektrondigte streke gehad het wat AJ aandui (pyle), het kd-selle (Fig. 3J) groot, aangrensende streke van hoë elektrondigtheid wat AJ aandui langs die apikobasale vlak getoon..Daarbenewens het ons op transversale snitte uitgebreide selmembraanvoue in kd-selle waargeneem (Fig. S1A, B), wat die uitgebreide patroon van β-catenin en E-cadherin kleuringsbande verduidelik (Fig. 3F, H).Ter ondersteuning van die rol van SPECC1L in AJs, is β-catenin mede-geïmmunopresipiteer met SPECC1L in lysate van samevloeiende U2OS selle (Fig. 3K).Saam met uitgebreide immunokleuring vir AJ-merkers, was TEM-analise in ooreenstemming met ons hipotese dat SPECC1L-tekort AJ apikaal-basale digtheid en variansie verhoog.
(AH) Verhoogde F-aktienkleuring in kd-selle 48 uur na samesmelting (T6; A, B).Veranderde kleuring van miosien IIb geassosieer met F-aktien (C, D).Die gladde patroon van β-catenin en E-cadherin membraan kleuring in kontroleselle (E, G) is verbeter in SPECC1L-kd (F, H) selle.Stawe = 10 µm.(I-J) Elektronmikrograwe wat die apikale-basale intersellulêre aansluiting waarneem.Kontroleselle toon duidelike elektrondigte streke wat klewerige aansluitings aandui (I, pyle).Daarteenoor het die hele apikale-basale aansluiting in SPECC1L-kd selle elektrondig voorgekom (J, pyle), wat dui op verhoogde digtheid en verspreiding van kleefverbindings.(K) β-katenien is saam met SPECC1L in samevloeiende U2OS-sellisate ge-immunopresipiteer.Beeld geneem vanaf een plek wat een van vier onafhanklike eksperimente voorstel.
Om die rol van SPECC1L in kraniofasiale morfogenese te verstaan, het ons 'n Specc1l-defekte muismodel geskep deur twee onafhanklike ES-vangsellyne, DTM096 en RRH048 (BayGenomics, CA), wat intron 1 verteenwoordig, en Specc1l-transkripsies is by 15 vasgelê (Fig. 1) .4A, figuur S2).Die genomiese ligging van die lokvektor-insetsel is deur heelgenoomvolgordebepaling bepaal en deur PCR bevestig (Fig. S2).Beide geenvanger-ontwerpe het ook in-raam samesmelting van die Specc11-lacZ verslaggewers toegelaat tydens vang.Daarom is lacZ-uitdrukking wat deur X-gal-kleuring bepaal is, gebruik as 'n aanduiding van Specc11-uitdrukking.Albei allele het soortgelyke lacZ-uitdrukkingspatrone getoon, met die DTM096-geenval in intron 1 wat sterker uitdrukking as RRH048 in intron 15 getoon het (nie getoon nie).Specc1l word egter wyd uitgedruk, met besonder sterk uitdrukking in die neurale voue by E8.5 (Figuur 4B), in die neuraalbuis en gesigprosesse by E9.5 en E10.5 (Figuur 4C,D), en in ontwikkelende ledemate by E10.5 en oë (Figuur 4D).Ons het voorheen gerapporteer dat SPECC1L uitdrukking in die eerste faringeale boog by E10.5 teenwoordig was in die epiteel en onderliggende mesenchiem18, in ooreenstemming met die CNCC-lyn.Om SPECC1L uitdrukking in CNCC te toets, het ons E8.5 neurale voue (Figuur 4E-J) en E9.5 skedelafdelings (Figuur 4K-) uitgevoer.By E8.5 het SPECC1L neurale voue intens gekleur (Fig. 4E, H), insluitend selle wat met NCC-merkers gekleur is (Fig. 4G, J).By E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) sterk gekleur migrerende CNCC saamgekleur met AP2A (Fig. 4L, M) of SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Skematiese voorstelling van die muis Specc11 geen wat lokvektor invoeging in ES DTM096 (intron 1) en RRH048 (intron 15) selklone toon.(BD) lacZ-kleuring van heterosigotiese Specc1lDTM096-embrio's wat Specc1l-uitdrukking van E8.5 tot E10.5 verteenwoordig.NE = neuroektoderm, NF = neurale vou, PA1 = eerste faringeale boog.(EP) SPECC1L immuunkleuring met NCC merkers AP2A en SOX10 in E8.5 (NF; EJ) neurale voue en E9.5 (KP) skedelafdelings.SPECC1L-kleuring is wyd waargeneem in neurale voue E8.5 (E, H; pylpunte), insluitend selle gemerk met AP2A (F, G; pylpunte) en SOX10 (I, J; pylpunte).By E9.5 het SPECC1L migrerende CNCC's sterk gekleur (K, N; pyle) gemerk AP2A (L, M; pyle) en SOX10 (O, P; pyle).
Kruising tussen heterosigotiese Specc1lDTM096/+ en Specc1lRRH048/+ muise toon dat die twee geenvanger-allele nie komplementêr is nie en dat saamgestelde heterosigote en embrioniese homosigote vir enige geenval-allele embrionies dodelik is (Tabel S1).Mendeliese verhoudings het 'n afname in die oorlewingsyfer van heterosigote by geboorte aangedui (verwag 1.34 vs. 2.0).Ons het opgemerk lae perinatale mortaliteit onder heterosigote, sommige het kraniofasiale anomalieë (Fig. S3).Die lae penetrasie van hierdie perinatale kraniofaciale fenotipes maak dit egter moeilik om hul onderliggende patofisiologiese meganismes te bestudeer.Daarom het ons gefokus op die embrioniese dodelike fenotipe van homosigotiese Specc11-mutante.
Die meeste saamgestelde heterosigotiese of homosigotiese Specc1lDTM096/RRH048 mutante embrio's het nie ontwikkel na E9.5-10.5 (Fig. 5A-D), en die neuraalbuis het nie anterior gesluit nie (Fig. 5B, D) en soms posterior gesluit (nie getoon nie) ..Hierdie kraniale neurale buis sluiting defek was geassosieer met die meerderheid van CNCC gemerk DLX2 wat in die neurale voue by E10.5 oorbly, wat geen disseksie aandui nie (Figuur 5A'-D').Om te bepaal of die algehele grootte van CNCC ook verminder is, het ons CNCC-lyne met GFP in ons geenvang-lyne met Wnt1-Cre en ROSAmTmG gemerk.Ons stroom gesorteerde GFP+ NCC en GFP- (RFP+) nie-NCC uit heel embrio's.By E9.5 het die proporsie van vloeigesorteerde GFP-gemerkte CNCC's nie betekenisvol verander tussen WT en mutante embrio's (nie getoon nie), wat normale CNCC-spesifikasie aandui.Daarom het ons veronderstel dat oorblywende Wnt1-Cre- en DLX2-kleuring in blootgestelde neurale voue (Figuur 5B') te wyte was aan gebrekkige CNCC-lae, moontlik as gevolg van verhoogde digtheid of verspreiding van AJ-selle, soos gesien in SPECC1L-kd-selle.Ons het die NCC-merkers SOX10, AP2A en DLX2 gebruik om die teenwoordigheid van CNCC in die neurale vou te bevestig (Figuur 5E-R).By E8.5 is neurale voukleuring vir al drie NCC merkers waargeneem in afdelings van WT (Fig. 5E, G, I) en Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).By E9.5, terwyl NCC-merkers migrerende NCC in WT-afdelings gekleur het (Fig. 5M, O, Q), is residuele NCC-kleuring waargeneem in blootgestelde neurale voue van Specc1l-mutante embrio's (Fig. 5N, P, R).Omdat SOX10 en DLX2 migrerende CNCC's merk, dui hierdie resultaat daarop dat SPECC1L-tekorte CNCC's post-migratoriese spesifikasie bereik, maar nie uit neurale voue migreer nie.
Specc11-tekort lei tot gebrekkige neurale buis sluiting, delaminering van kraniale neurale kruin selle en AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrio-draende migrerende kraniale neurale kuifselle (CNCC) gemerk met Wnt1-Cre (A').In teenstelling hiermee toon Specc11 mutante embrio's oop neurale voue (B), pylpunte) en CNCC's wat nie gemigreer het nie (B', pylpunte).(C, D') Helderveldbeelde (C, D') en immunokleuring (C', D') van die CNCC merker DLX2 van E10.5 WT embrio's (C, C') en Specc1l (D, D').In WT E10.5 embrio's koloniseer DLX2-positiewe CNCC die kieuboë (C', pyle), terwyl opvallende kleuring by mutante voortduur in die oop neurale voue (D', pyle) en in die eerste faringeale boë (D', pyle).) met 'n mate van kleuring (pyle) wat swak delaminering en migrasie van CNCC aandui.ER) Afdelings van WT en Specc1l mutante embrio's in stadiums E8.5 (E–L) en E9.5 (M–R) is gemerk met NCC merkers SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) en DLX2 (I, J, Q, R).By E8.5 is NCC-kleuring waargeneem in wilde-tipe neurale vou (NF) en mutante afdelings.Gesamentlike kleuring van SOX10 en β-catenin in E8.5 WT (K) en mutant (L) het verhoogde β-catenin-kleuring by selgrense in die neurale voue geopenbaar.By E9.5 is wilde-tipe kleuring van migrerende CNCC's (M, O, Q) waargeneem, terwyl ongestratifiseerde CNCC's in mutante oop neurale voue gekleur het (N, P, R).(S-Z) In vivo AJ-etiketteringsanalise in koronale afdelings van WT- en Specc11DTM096/RRH048-embrio's met die E9.5-mutasie.'n Geskatte deursneevlak word in die regter boonste hoek getoon.In gedeeltes van mutante weefsels is verhoogde kleuring van F-aktien (S, T) en miosien IIb (U, V) waargeneem.Soortgelyk aan die in vitro resultate in Fig. 3, in mutante embrio's, is verbeterde membraankleuring vir β-catenin (W, X) en E-cadherin (Y, Z) waargeneem.(AA-BB) 'n Elektronmikrograaf van 'n gedeelte van 'n wilde-tipe embrio wat verby die grens van die apikale-basale sel kyk, toon 'n duidelike elektrondigte gebied wat dui op kleefverbindings (AA, pyle).Daarteenoor, in dele van Specc11 mutante embrio's (BB, pyle), is die hele apikobasale aansluiting elektrondig, wat 'n verhoogde digtheid en verspreiding van kleefverbindings aandui.
Om ons hipotese te toets dat verminderde lae te wyte is aan veranderde AJ, het ons AJ-etikettering in blootgestelde neurale voue van Specc1l mutante embrio's ondersoek (Fig. 5S-Z).Ons het 'n toename in actin stres vesels (Fig. 5S, T) en 'n gepaardgaande verhoogde lokalisering van miosien IIB kleuring op actin vesels (Fig. 5U, V) waargeneem.Dit is belangrik dat ons verhoogde kleuring van β-catenin (Figuur 5W, X) en E-cadherin (Figuur 5Y, Z) by intersellulêre grense waargeneem het.Ons het ook β-catenin-kleuring van NCC in die neurale voue van E8.5-embrio's ondersoek (Fig. 5K, L).β-catenin kleuring blyk sterker te wees in Specc1l mutante neurale voue (Fig. 5L en K), wat daarop dui dat AJ veranderinge begin het.In elektronmikrofoto's van skedelafdelings van E9.5-embrio's het ons weer verhoogde diffuse elektron-digte kleuring in Specc1l mutante embrio's waargeneem in vergelyking met WT (Fig. 5AA, BB en S1E-H).Saamgevat ondersteun hierdie resultate ons in vitro resultate in SPECC1L-kd U2OS-selle en stel voor dat afwykende AJ-kleuring CNCC-stratifikasie in ons mutante embrio's voorafgaan.
Gegewe die bekende antagonistiese verhouding tussen AKT-aktiwiteit en E-cadherin-stabiliteit, 17,28 het ons die betrokkenheid van PI3K-AKT-sein veronderstel.Daarbenewens het ons subepidermale blaasvorming in sommige van ons mutante embrio's waargeneem wat dodelikheid ontsnap het (<5%) by E9.5-10.5 en eerder op ongeveer E13.5 gevestig het (Fig. S3).Subepidermale vesikels is 'n kenmerk van verminderde PI3K-AKT-sein gebaseer op PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) het berig dat ontwrigting van PDGFRα-gebaseerde PI3K-aktivering in PdgfraPI3K/PI3K mutante embrio's tot subepidermale vesikels, neuraalbuisdefekte en gesplete verhemelte fenotipes lei.Inderdaad, vlakke van pan-AKT en aktiewe gefosforileerde Ser473-AKT is verminder in vivo in Specc1l mutante weefsels tot E9.5 embrioniese arrestasie (Fig. 6A-D).Die afname in vlakke van gefosforileerde Ser473-AKT kan geheel en al te wyte wees aan die afname in vlakke van pan-AKT in vivo (FIG. 6E) en in vitro (FIG. 6F).'n In vitro afname is slegs waargeneem wanneer U2OS-selle sterk saamvloei met veranderinge in selvorm en AJ-digtheid (Figuur 6D).Dus, ons data dui daarop dat SPECC1L 'n nuwe positiewe reguleerder is van PI3K-AKT sein in kraniofasiale morfogenese.
(A–E) E8.5 (A,B) en E9.5 (C,D) skedelafdelings of E9.5 lysate van Specc1l mutante embrio's (E) wat vlakke van aktiewe gefosforileerde S473-AKT en pan-AKT Proteïenvermindering toon , in vergelyking met beheer WT.Western blotting is uitgevoer op wildtipe lisate en mutant lisate onder dieselfde toestande.Die beelde wat vir SPECC1L gewys word, is van een klad geneem.Dieselfde klad is verwyder en weer ondersoek met anti-pan-ACT en β-aktien teenliggaampies.Pan-AKT-vlakke in E8.5 neurale voue (A, B) en vlakke van gefosforileerde S473-AKT in E9.5 skedelafdelings is aansienlik verminder.(F) Pan-AKT vlakke is soortgelyk verminder in lysate van SPECC1L-kd U2OS selle wat by hoë samevloeiing geoes is.Foutstawe verteenwoordig SEM's van drie onafhanklike Western blot-kwantifikasies.(GJ) Seksies van WT-embrio's by E9.5 wat onderskeidelik met KI67 en gekliefde kaspase 3 gekleur is, wat selproliferasie (G, G') en min apoptotiese aktiwiteit (H, H') toon.Specc11 mutante embrio's toon vergelykbare selproliferasie (I), maar die aantal selle wat apoptose ondergaan, is aansienlik verhoog (J).
Ons het dan merkers van proliferasie en apoptose ondersoek.Ons het geen verskil in die proliferasie van E9.5-embrio's (Fig. 6E, G in vergelyking met I) waargeneem met 'n proliferasie-indeks van 82.5% vir WT-mutante en 86.5% vir Specc1l-mutante gemeet deur KI67-kleuring (p <0.56, Fisher's) presiese toets).Net so het ons geen verskil in apoptose waargeneem, gemeet deur kleuring vir gekloofde kaspase 3 in neurale voue by E8.5 tot embrio-arrestasie (nie gewys nie) (nie gewys nie).In teenstelling hiermee was apoptose aansienlik verhoog in alle E9.5 mutante embrio's (Fig. 6F, H en J).Hierdie algehele toename in apoptose stem ooreen met verminderde PI3K-AKT-sein en vroeë embrioniese dodelikheid29,30,31.
Vervolgens, om 'n oorsaaklike rol vir PI3K-AKT-sein in AJ-veranderinge in ons kd-selle te bevestig, het ons die pad in beheer- en kd-selle chemies verander (Figuur 7A-F).Ons het as merker die fenotipe van selvormverandering wat in samevloeiende SPECC1L-kd-selle waargeneem is, gebruik, wat ons gekwantifiseer het deur die verhouding van die langste dimensie (lengte) tot die ooreenstemmende vertikale dimensie (breedte) te gebruik.'n Verhouding van 1 word verwag vir relatief ronde of kubusvormige selle (Figuur 7G).Benewens selvorm, het ons ook die effek op AJ bevestig deur β-catenin-kleuring (Fig. 7A'-F').Inhibisie van die PI3K-AKT-weg met behulp van wortmannin was voldoende om selvorm in kontroleselle (Figuur 7A,C) en AJ (Figuur 7A') te verander.PI3K-AKT-aktiveerder SC-79 het nie selvorm (FIG. 7A, E) of AJ-uitbreiding (FIG. 7A') in kontroleselle beïnvloed nie.In SPECC1L-kd selle het verdere onderdrukking van die PI3K-AKT pad gelei tot verhoogde apoptose (Fig. 7B, D) en 'n merkbare toename in β-catenin kleuring (Fig. 7B'), in ooreenstemming met ons in vivo swaar mutante.Dit is belangrik dat aktivering van die PI3K-AKT-roete selvorm (Figuur 7B, F) en AJ-fenotipes (Figuur 7B") aansienlik verbeter het.Veranderinge in selvorm is gekwantifiseer as selrondheidsverhouding (CCR) en vergelyk vir betekenisvolheid soos hierbo beskryf (FIG. 7G).Inderdaad, in kontroleselle (Fig. 7G, CCR = 1.56), was wortmanninbehandeling voldoende om die selvorm aansienlik te verander (Fig. 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) tot 'n mate soortgelyk aan die een wat waargeneem is. in SPECC1L.-kd selle (Fig. 7G, CCR = 3.46).Wortmannin-behandeling van SPECC1L-kd-selle (Fig. 7G, CCR = 3.60, weglaatbaar) was nie meer betekenisvol as onbehandelde kd-selle (Fig. 7G, CCR = 3.46, weglaatbaar) of wortmannin-behandelde kontroleselle (Fig. 7G)., CCR = 3.46, weglaatbaar) beïnvloed ook selverlenging (7G, CCR = 3.61, weglaatbaar).Die belangrikste is dat SC-79 AKT-aktiveerder die verlengde fenotipe van SPECC1L-kd-selle herstel het (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Hierdie resultate bevestig dat SPECC1L PI3K-AKT sein reguleer en stel voor dat 'n matige afname in SPECC1L seladhesie beïnvloed, terwyl 'n sterk afname tot apoptose lei (Fig. 8).
(A–F') Kontrole (A, C, E) en SPECC1L-kd (B, D, F) selle behandel met PI3K-AKT pad inhibeerder wortmannin (C, D) of SC-79 aktiveerder (E, F) Behandeling .Onbehandelde kontroleselle is kubusvormig (A) met normale β-kat sellulêre kleuring (A'), terwyl kd selle verleng is (B) met verhoogde β-kat kleuring (B').Na onderdrukking van die PI3K-AKT-weg, het kontroleselle verleng (C) met β-kat-uitbreiding (C'), terwyl kd-selle apoptose (D) begin ondergaan het, soortgelyk aan ons hoogs gemuteerde embrio's en uiters verbeterde β-kat toon.kleuring (D').Na aktivering van die PI3K-AKT-weg, het kontroleselle kubusvormig (E) gebly en normale β-kat (E') kleuring gehad, terwyl kd selle aansienlik verbeterde selvorm (F) en β-kat (F') kleuring getoon het, wat aandui (G) Die mate van selvormverandering in (AF) is gekwantifiseer deur gebruik te maak van die selrondingsverhouding (CCR) van die langste dimensie (lengte) en die ooreenstemmende vertikale dimensie (breedte) met behulp van MetaMorph sagteware.Onbehandelde (NT) SPECC1L-kd selle (CCR = 3.46) was aansienlik langer as kontroleselle (CCR = 1.56, p < 6.1 × 10-13).Wort se inhibisie van die PI3K-AKT pad in kontroleselle was voldoende om 'n soortgelyke verlenging in selvorm te veroorsaak (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Net so, AKT aktivering deur SC-79 in SPECC1L-kd selle herstel sel verlenging na beheer vlakke (CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Wortmannin behandeling van SPECC1L-kd selle het gelei tot verhoogde apoptose maar geen verdere toename in selvorm verandering (CCR=3.60) in vergelyking met onbehandelde kd (CCR=3.46, ns) of wortmannin-behandelde kontroleselle (3.61) waargeneem in.ns = maak nie saak nie.+/- SEM-metings vir 50 selle word getoon.Statistiese verskille is met behulp van Student se t-toets bereken.
(A) Skematiese voorstelling van inhibisie en aktivering van die PI3K-AKT-weg wat onderskeidelik AJ-veranderinge en redding tot gevolg het.(B) Voorgestelde model vir AKT-proteïenstabilisering deur SPECC1L.
Premigratoriese CNCC's vereis AJ-lise om van anterior neurale vou neuroepiteel selle te skei1,15,32.Verhoogde kleuring van AJ komponente en verlies van die apikaal-basale AJ asimmetriese verspreiding in SPECC1L-tekorte selle beide in vitro en in vivo, gekombineer met die fisiese nabyheid van SPECC1L aan β-catenien, dui daarop dat SPECC1L funksioneer om AJ plaaslike stabiliteit behoorlik te handhaaf vir organisasie spiere.aktien sitoskelet.Die assosiasie van SPECC1L met die aktien-sitoskelet en β-katenien en die toename in die aantal gekondenseerde aktienfilamente in die afwesigheid van SPECC1L stem ooreen met die waargenome toename in AJ-digtheid.Nog 'n moontlikheid is dat 'n verhoogde aantal aktienvesels in SPECC1L-tekorte selle lei tot 'n verandering in intersellulêre spanning.Omdat sellulêre spanning AJ 33-dinamika beïnvloed, kan spanningsveranderinge meer diffuse AJ 34 tot gevolg hê.So enige veranderinge sal die CNCC-lae beïnvloed.
Wnt1 word uitgedruk in die vroeë neurale voue wat aanleiding gee tot neurale kruin-selle.Dus, Wnt1-cre-afstammingsnasporing merk beide voor- en migrerende NCC35.Wnt1 merk egter ook dorsale breinweefselklone wat ook afkomstig is van vroeë neurale voue 35,36, wat dit waarskynlik maak dat ons kleuring van E9.5 mutante vir Wnt1 merkers in oop neurale voue nie CNCC is nie.Ons positiewe kleuring vir die NCC merkers AP2A en SOX10 het bevestig dat die blootgestelde neurale voue van Specc11 mutante embrio's wel CNCC bevat het.Daarbenewens, aangesien AP2A en SOX10 merkers van vroeë migrerende NCC is, het positiewe kleuring aangedui dat hierdie selle post-migratoriese CNCC is wat nie deur E9.5 gestratifiseer kan word nie.
Ons data dui daarop dat molekulêre regulering van AJ deur SPECC1L bemiddel word deur PI3K-AKT sein.AKT-sein word verminder in SPECC1L-tekorte selle en weefsels.Bevindinge deur Fantauzzo et al.ondersteun 'n direkte rol vir PI3K-AKT sein in kraniofasiale morfogenese.(2014) het getoon dat die gebrek aan aktivering van PDGFRα-gebaseerde PI3K-AKT sein lei tot 'n gesplete verhemelte fenotipe.Ons wys ook dat inhibisie van die PI3K-AKT-roete voldoende is om AJ en selvorm in U2OS-selle te verander.In ooreenstemming met ons bevindings, Cain et al.37 het getoon dat afregulering van die PI3K α110 subeenheid in endoteelselle 'n soortgelyke toename in perisellulêre β-katenienkleuring tot gevolg het, waarna verwys word as 'n toename in die "konnektiwiteitsindeks".In endoteelselle waarvan die aktienfilamente reeds hoogs georganiseer is, lei onderdrukking van die PI3K-AKT-weg egter tot 'n los selvorm.Daarteenoor het SPECC1L-kd U2OS-selle 'n verlengde selvorm getoon.Hierdie verskil kan seltipe spesifiek wees.Terwyl onderdrukking van PI3K-AKT-sein die aktien-sitoskelet permanent beïnvloed, word die effek op selvorm bepaal deur veranderinge in spanning wat veroorsaak word deur veranderinge in die digtheid en organisasie van sentrale aktienvesels.In U2OS-selle het ons slegs selvormveranderinge gebruik as 'n merker van SPECC1L-tekorte AJ verandering en herstel.Ten slotte veronderstel ons dat inhibisie van die AKT-weg in SPECC1L-tekort AJ-stabiliteit verhoog en delaminering in CNCC verminder.
Interessant genoeg is pan-AKT-vlakke in vitro en in vivo verlaag bykomend tot gefosforileerde 473-AKT-vlakke in die afwesigheid van SPECC1L, wat regulering van PI3K-AKT-sein op die vlak van AKT-proteïenstabiliteit of omset voorstel.Die SPECC1L- en MID1-gene, beide geassosieer met Opitz/GBBB-sindroom, kodeer proteïene wat mikrotubuli stabiliseer 18,22.Die meganisme waardeur SPECC1L en MID1 mikrotubuli-stabilisering bemiddel word nie ten volle verstaan ​​nie.In die geval van SPECC1L sluit hierdie stabilisering verbeterde asetilering van 'n subset van mikrotubules 18 in.Dit is moontlik dat SPECC1L 'n soortgelyke meganisme gebruik om ander proteïene soos AKT te stabiliseer.Dit is getoon dat asetilering van lisienreste in die AKT-proteïen lei tot 'n afname in membraanlokalisering en fosforilering38.Daarbenewens word ubiquitinering van die K63-ketting by dieselfde lisienresidu op AKT vereis vir sy membraanlokalisering en aktivering39,40.Onder verskeie faktore wat in wisselwerking met SPECC1L proteïene geïdentifiseer is in verskeie hoë deurset gis twee-hibriede skerms, is vier – CCDC841, ECM2942, APC en UBE2I43 – geïmpliseer in proteïenomset of stabiliteit via ubiquitinering of sumoylering.SPECC1L kan betrokke wees by post-translasie-modifikasie van AKT-lisienresidu, wat AKT-stabiliteit beïnvloed.Die kritieke rol van SPECC1L in die lokalisering en stabiliteit van die AKT-proteïen moet egter nog uitgeklaar word.
Ernstige defekte in SPECC1L uitdrukking in vivo het gelei tot verhoogde AJ merker kleuring en gebrekkige CNCC oorleg, sowel as verhoogde apoptose en vroeë embrioniese dodelikheid.Vorige verslae het getoon dat muismutante met verhoogde vlakke van apoptose geassosieer word met neuraalbuisdefekte 44,45,46,47 en kraniofaciale defekte48.Daar is voorgestel dat oormatige seldood in die neurale voue of faringeale boë kan lei tot 'n onvoldoende aantal selle wat nodig is vir behoorlike morfogenetiese beweging 48,49,50.In teenstelling hiermee het ons SPECC1L gebrekkige sellyne met matig verminderde SPECC1L uitdrukking slegs AJ veranderinge getoon sonder bewyse van verhoogde seldood.Chemiese inhibisie van die PI3K-AKT-weg in hierdie Kd-selle het egter tot verhoogde apoptose gelei.Dus, 'n matige afname in SPECC1L uitdrukking of funksie verseker sel oorlewing.Dit stem ooreen met die waarneming dat skaars Specc11 mutante embrio's wat arrestasie by st.E9.5 - miskien as gevolg van verminderde geenvangsdoeltreffendheid - is in staat om hul neurale buise toe te maak en later in ontwikkeling te stop, dikwels met kraniofaciale defekte (Fig. S3).Ook in ooreenstemming hiermee is die seldsame voorkoms van heterosigotiese Specc1l-embrio's met kraniofasiale abnormaliteite—waarskynlik as gevolg van verhoogde geenvangdoeltreffendheid—asook die bevinding in sebravis waarin een van die twee SPECC1L-ortoloë (specc1lb) laat embrioniese fenotipes veroorsaak, insluitend verlies van onderkake en bilaterale splete51.Dus, heterosigotiese SPECC1L-verlies-van-funksie-mutasies wat in menslike pasiënte geïdentifiseer is, kan klein inkortings in SPECC1L-funksie tydens kraniofasiale morfogenese veroorsaak, voldoende om hul orofasiale splete te verduidelik.SPECC1L-gebaseerde regulering van intersellulêre kontakte kan ook 'n rol speel in palatogenese en samesmelting van die faringeale boë.Verdere studies van SPECC1L-funksie sal help om die rol van tydelike intersellulêre kontakte in CNCC tydens neuraalbuissluiting in neuroepiteel-selmotiliteit en kraniofasiale morfogenese toe te lig.
U2OS osteosarkoom beheer en SPECC1L-kd selle is voorheen beskryf (Saadi et al., 2011).Teenliggaampies teen SPECC1L is ook voorheen gekarakteriseer (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin teenliggaampies (haas; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (muis; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miosien IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornië), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), gekliefde kaspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) en β-aktien (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) is gebruik soos beskryf..Actin filamente is gekleur met Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS kontroleselle en SPECC1L-kd selle is gekweek in standaard hoë glukose DMEM aangevul met 10% fetale bees serum (Life Technologies, Carlsbad, CA).Vir AJ veranderinge is 2 x 105 selle gesaai op glas wat behandel is met 0.1% varkgelatien (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en waargeneem vir veranderinge in selvorm.Selle is op verskillende aangeduide tye versamel: 4 uur na saai (t = 1), 24 uur na saai (t = 2), samevloeiing sonder verandering in selvorm (t = 3), verandering in selvorm (t = 4) , 24 uur na selvormverandering (t = 5) en 48 uur na selvormverandering (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Om die PI3K-AKT pad te moduleer, is selle gekweek by die aangeduide konsentrasies met die PI3K-AKT inhibeerder wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) of SC-79 aktiveerder (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Die medium wat die chemikalieë bevat, is daagliks verander.
Raam-vir-raam opnames is gemaak op lewendige kontrole en KD selle onder normale kultuur toestande, en fase kontras beelde is elke 10 minute vir 7 dae versamel.Beelde is verkry deur gebruik te maak van 'n rekenaarbeheerde Leica DM IRB omgekeerde mikroskoop toegerus met 'n meganiese verhoog en 'n 10 × N-PLAN objektief gekoppel aan 'n QImaging Retiga-SRV kamera.Tydens beeldvorming is selkulture by 37°C in 'n vogtige atmosfeer met 5% CO2 gehandhaaf.
Twee geenvanger ES-sellyne DTM096 en RRH048 van die Regional Mutant Mouse Resource Centre (UC Davis, CA) is gebruik om Specc11-defekte muislyne, aangedui Specc1lgtDTM096 en Specc1lgtRRH046, te genereer.Kortliks, 129/REJ ES-selle is in C57BL6 blastosiste ingespuit.Die resulterende chimeriese manlike muise is met vroulike C57BL6-muise geteel om nageslag met agouti-pelskleur te identifiseer.Die teenwoordigheid van geenvangvektor-inserts is gebruik om heterosigote te identifiseer.Muise is op 'n gemengde agtergrond van 129/REJ;C57BL6 gehou.Die ligging van die invoegplek van die genetiese lokvalvektor is bevestig deur RT-PCR, genoomvolgordebepaling en genetiese komplementering (Aanvullende Figuur 1).Om die CNCC-lyn van dubbele heterosigotiese Specc1lGT-muise na te spoor, is ROSAmTmG (#007576) en Wnt1-Cre (#003829) muise (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) gekruis om die ROSAmTmG en Wnt1-Cres1ol alleel in Specc1-embryol te produseer.Alle eksperimente in muise is uitgevoer volgens protokolle wat deur die Institusionele Dieresorg- en Gebruikskomitee van die Universiteit van Kansas Mediese Sentrum goedgekeur is.
Embrio's is in (1% formaldehied, 0.2% glutaaraldehied, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) vir 60 min by kamertemperatuur gefixeer.Na fiksasie in X-gal-kleuroplossing (5 mM kaliumferrisianied, 5 mM kaliumferrosianied, 2 mM MgCl2, 0.01% natriumdeoksicholaat, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) is vlekontwikkeling by 37°C uitgevoer .°C binne 1-6 uur.Embrio's is na-gefikseer in 4% PFA en gevisualiseer.
Vir Western blotting is selle gelys in passiewe lisis buffer (Promega, Fitchburg, WI) aangevul met 'n mengsel van HALT protease inhibeerders (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysate is verwerk op 12% poliakrielamied Mini-PROTEAN TGX klaargemaakte gels (Bio-Rad, Hercules, CA) en oorgedra na Immobilon PVDF membrane (EMD Millipore, Billerica, MA).Die membrane is geblokkeer in 5% melk in PBS wat 0.1% Tween bevat.Teenliggaampies is oornag by 4°C of vir een uur by kamertemperatuur geïnkubeer.Femto SuperSignal West ECL reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA) is vir seingenerering gebruik.Vir immunokleuring is embrio's oornag in 4% PFA/PBS gefixeer en gekriopreserveer.Weefselkryoseksies is geblokkeer in PBS wat 1% normale bokserum (Thermo Scientific, Waltham, MA) en 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) bevat en dan by 4°C in 'n broeikas geïnkubeer tydens die nag.met anti-teenliggaampies en fluoresserende sekondêre teenliggaampies (1:1000) vir 1 uur by 4°C.Gekleurde snitte is in ProLong goue medium (Thermo Scientific, Waltham MA) geplaas en plat beelde is verkry met behulp van 'n Leica TCS SPE konfokale mikroskoop.Elke immunokleuring is uitgevoer as drie onafhanklike eksperimente op dwarssnitte van ten minste twee mutante embrio's.'n Verteenwoordigende eksperiment word getoon.
Selle is geïnkubeer in gemodifiseerde RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliserol, 2 mM EDTA en HALT-protease-inhibeerder (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Kortliks, lysate is vooraf gesuiwer met proteïen G magnetiese krale (Life Technologies, Carlsbad, CA) en dan oornag by 4° C geïnkubeer. met anti-SPECC1L of IgG proteïen G proteïen krale is gebruik om SPECC1L te onttrek en Western klad is uitgevoer met behulp van die anti-SPECC1L of IgG proteïen G proteïenkrale. -β-catenin teenliggaampie hierbo beskryf Die mede-IP eksperimente wat getoon word is verteenwoordigend van vier onafhanklike eksperimente.
Vaste gekweekte selle of muis-embrioniese weefsels is aan die elektronmikroskopiesentrum by die Universiteit van Kansas Mediese Sentrum verskaf.Kortliks, monsters is ingebed in EMbed 812 hars (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), oornag by 60°C gepolimeriseer en teen 80 nm gesny met 'n Leica UC7 ultramikrotoom toegerus met 'n diamantlem.Seksies is gevisualiseer met behulp van 'n JEOL JEM-1400 transmissie elektronmikroskoop toegerus met 'n 100 kV Lab6 geweer.
Hoe om hierdie artikel aan te haal: Wilson, NR et al.Tekort aan SPECC1L lei tot verhoogde stabiliteit van gesplitste gewrigte en verminderde delaminering van kraniale neurale kuifselle.die wetenskap.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induksie en differensiasie van die neurale kruin.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Kraniale neurale kuifselle in beweging: hul rol in kraniofaciale ontwikkeling.Amerikaanse Tydskrif vir Mediese Genetika.Deel A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurokristopathia: sy groei en ontwikkeling oor 20 jaar.Pediater.patologie.laboratorium.medisyne.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU en Noten MM Deurbraak in die genetika van orofasiale splete.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. en Riley, FM Molekulêre meganismes van kraniale neurale kruin-selmigrasie en patroonvorming tydens kraniofaciale ontwikkeling.Ontwikkeling 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH en Murray, JK Gesplete lip en verhemelte: begrip van genetiese en omgewingsinvloede.natuurlike kommentaar.Genetika 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Abnormale morfogenese van die vel, ledemate en kraniofasiale streek in interferon-regulerende faktor-6 (Irf6)-tekorte muise.Nasionale Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominante mutasies in GRHL3 veroorsaak van der Waord-sindroom en benadeel ontwikkeling van die orale periderm.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ en Juriloff, DM Werk die lys van muismutante met defekte in neuraalbuissluiting op en vorder na 'n volledige genetiese begrip van neuraalbuissluiting.Ondersoek van geboortedefekte.Deel A, Kliniese en Molekulêre Teratologie 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-gemedieerde PDGFRalpha-sein reguleer oorlewing en proliferasie in skeletontwikkeling deur 'n p53-afhanklike intrasellulêre pad.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND en Murdoch, JN Disheveled: Verwantskap van konvergente uitbreiding tot neurale buis sluiting.Tendense in neurologie.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).