347 vlekvrye staal opgerolde buis chemiese komponent, identifikasie van nuwe interferon-responsiewe menslike leukosiet antigeen-A (HLA-A) chaperone proteïene met behulp van kruisgekoppelde massaspektrometrie (CLMS)

Dankie dat jy Nature.com besoek het.Jy gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).Daarbenewens, om deurlopende ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.
Sliders wat drie artikels per skyfie wys.Gebruik die terug- en volgende-knoppies om deur die skyfies te beweeg, of die skyfiebeheerknoppies aan die einde om deur elke skyfie te beweeg.

Produk Beskrywing

Vlekvrye staal 347L spoelbuise, staalgraad: SS347L

Die interferon-seinstelsel veroorsaak 'n sterk sitokienreaksie op 'n wye reeks patogeniese en intrinsieke patologiese seine van die omgewing, wat lei tot die induksie van subsets van interferon-induseerbare proteïene.Ons het DSS-gemedieerde kruiskoppeling massaspektrometrie (CLMS) toegepas om nuwe proteïen-proteïen interaksies in die domein van interferon-geïnduseerde proteïene op te spoor.Benewens die verwagte interferon-induseerbare proteïene, het ons ook nuwe intermolekulêre en intramolekulêre kruisgekoppelde addukte van kanoniese interferon-induseerbare proteïene soos MX1, USP18, OAS3 en STAT1 geïdentifiseer.Ons het gefokus op ortogonale validering van 'n nuwe stel interferon-induseerbare proteïennetwerke wat gevorm word deur HLA-A-proteïene (H2BFS-HLA-A-HMGA1) deur gebruik te maak van ko-immunopresipitasie en hul verdere studie deur gebruik te maak van molekulêre dinamika-modellering.Modellering van die konformasiedinamika van die proteïenkompleks het verskeie interaksieterreine aan die lig gebring wat die interaksies weerspieël wat in die CLMS-bevindinge geïdentifiseer is.Saam bied ons 'n loodsstudie van CLMS aan om nuwe seinkomplekse te identifiseer wat deur interferon geïnduseer word, en sien uit na die wyer gebruik van CLMS om nuwe dinamika van proteïeninteraksies in die tumormikro-omgewing te identifiseer.
Voordat 'n aanpasbare immuunrespons begin, begin die gasheer se aangebore verdedigingstelsel 'n antimikrobiese reaksie bemiddel deur 'n familie van afgeskeide alfa-helikale sitokiene genoem interferone (IFN'e).Die tipe I IFN-klasse IFNα en IFNβ aktiveer sellulêre reaksies, insluitend antivirale, proapoptotiese, pro-inflammatoriese en antiproliferatiewe toestande.By mense is 13 subtipes van IFNα bekend, almal gegroepeer op chromosoom 91. Verbasend genoeg is slegs IFNα2 vir kliniese gebruik bestudeer.Onlangs is spesiale aandag geskenk aan navorsing oor ander subtipes van IFNα.'n Onlangse studie het getoon dat IFNα14 een van die mees effektiewe isovorme is om HBV2 en MIV-13,4 replikasie te beperk in vergelyking met die kanonieke IFNα2 subtipe.
Dit is vasgestel dat geaktiveerde tipe I interferon reseptor komplekse (IFNAR1 en IFNAR2) 'n seintransduksie kaskade veroorsaak wat deur Janus kinases TYK2 en JAK15,6 bemiddel word.Hierdie Janus-kinases fosforileer seintransduktors en transkripsionele proteïenaktiveerders (STAT1 en STAT2) op tirosienreste om SH2-domein-gemedieerde heterodimerisasie te inisieer6.Vervolgens bind IRF9 STAT-heterodimere om 'n trimeriese kompleks van die IFN-gestimuleerde faktor 3-geen (ISGF3) te vorm, wat na die kern translokeer en die transkripsie van meer as 2000 interferon-gestimuleerde gene (ISG's)5,6,7,8 induseer.
ISG's vorm die ruggraat van die aangebore immuunstelsel, veral in reaksie op virale aanval.As 'n eerste linie van verdediging teen virale infeksie, ontplooi selle vinnig uitgebreide interaksies van sellulêre proteïene met 'n wye reeks biologiese aktiwiteite.Hierdie proteïene sluit in patroonherkenningsreseptore, seinmolekules, transkripsiefaktore en proteïene met direkte antivirale funksies, sowel as negatiewe reguleerders van immuunresponse9.Baie van die inligting oor ISG-aktiwiteit kom van funksionele skerms wat ooruitdrukkingskerms10,11 of geenstilte-tegnieke (siRNA, RNAi en CRISPR)12,13 gebruik waarin individuele ISG's uitgedruk of geïnhibeer word en hul aktiwiteit op verskeie virusse getoets word.Alhoewel hierdie studies die antivirale eienskappe van individuele ISG's bepaal het, bly die onderliggende molekulêre meganismes van elke ISG grootliks onbekend.Dit word algemeen aanvaar dat baie proteïene met een of meer sitokiene interaksie het om volle aktiwiteit te verseker, dus óf ISG'e interaksie direk óf hul interaksies word deur sellulêre proteïene bemiddel.Byvoorbeeld, 'n onlangse fotokruisgekoppelde proteomika-studie het ATPase VCP/p97 geïdentifiseer as 'n belangrike IFITM3-interaksievennoot, wie se inhibisie lei tot defekte in lisosomale sortering, omset en medetransport van IFITM3 met virale deeltjies 14 .Deur immunopresipitasie te gebruik, het ons VAPA, 'n vesikel-geassosieerde proteïen, geïdentifiseer as 'n interaksievennoot met IFITM1/2/3 wat cholesterol-gemedieerde virale rypwording bemiddel, en dit is bevestig deur 'n ander studie wat 'n gis twee-hibriede sisteem gebruik.Wetenskaplike Ondersteuning 15, 16.
'n Fundamentele biologiese proses betrokke by die onderdrukking van infeksie en kwaadaardige transformasie is antigeenpresentasie, wat bemiddel word deur groot histoversoenbaarheidskompleks (MHC) molekules.Peptiede (8-12 aminosure lank) van gesplitste, voortydige beëindigde of verkeerd gevoude proteïene word in die MHC-I heterodimeer (bestaande uit MHC-I swaar en ligte kettings, genoem β-2-mikroglobulien; β2M) 17,18 gelaai.Die resulterende stabiele MHC-I trimere word na die seloppervlak vervoer, waar hulle intrasellulêre peptiede aan CD8+ T-selle (sitotoksiese T-selle)17 aanbied.T-selle herken en vernietig hierdie patogene en selle wat 'n tumor-spesifieke antigeen dra.Gevolglik onderdruk patogene en tumorselle dikwels die antigeenaanbiedingsproses om immuuntoesig te vermy.Daarbenewens word MHC-I afgereguleer in 40-90% van menslike gewasse en word dit dikwels met 'n swakker prognose geassosieer19.
Gene wat betrokke is by die reaksie op patogene moet vinnig wissel tussen 'n toestand van rus en 'n toestand van aktiewe transkripsie.Daarom word verskeie sellulêre proteïene veronderstel om betrokke te wees by die reaksie op hoë IFN-aanvraag oor kort tydperke, insluitend hermodellering en modifikasie van promotorchromatien 20,21.Die meeste studies het gefokus op die identifikasie van individuele ISG-proteïenvennote in die teenwoordigheid van IFN.Verskeie proteomiese en transkriptomiese studies in modelselstelsels het die effek van IFN op die sellulêre landskap toegelig.Ten spyte van 'n groeiende begrip van die dinamika wat deur interferone veroorsaak word, weet ons steeds min oor die betrokkenheid van ISG's.Wanneer die kompleksiteit en tydafhanklike dinamika van interferon-seining in ag geneem word, ontstaan ​​twee vrae: (i) is dit moontlik om die multiproteïenkomplekse wat by vinnige seinering betrokke is te stabiliseer en vas te vang, en (ii) kan hierdie interaksies in 3D-ruimte gekarteer word?
Om hierdie kwessies aan te spreek, het ons disuksinimied suberaat-gemedieerde chemiese kruisbinding (DSS) tesame met massaspektrometrie (CLMS) geïmplementeer om die IFNα-geïnduseerde proteïeninteraksienetwerk en sy dinamika te bestudeer.DSS voeg kovalente bindings tussen proksimale residue van proteïene en/of proteïenkomplekse in vivo by.Daaropvolgende MS-analise onthul spesifieke kruisbindingsplekke wat die ruimtelike nabyheid van streke binne 'n bepaalde proteïen weerspieël, genoem interne koppelings, of subeenhede in proteïenkomplekse, genoem interverwantskappe.Deur hierdie benadering te gebruik, het ons verskeie nuwe proteïen-proteïen komplekse sowel as interferon-geïnduseerde multiproteïen interaksie netwerke geïdentifiseer.Deur 'n subset van hierdie nuwe interaksies verder te toets, demonstreer ons dat H2BFS (H2B histoon-tipe FS; hierna verwys as H2B) en MDN1 as bindende vennote vir HLA-A optree.
Flo-1-selle is een van die bekendste in vitro-modelle van slokdarm-adenokarsinoom, aangesien hulle sleutelkenmerke van slokdarm-gewasse naboots22,23.Nie alle gewasse is egter immunogenies nie, en om vas te stel of Flo-1-selle op interferonbehandeling reageer, het ons Flo-1-selle vir 72 uur met 10 ng/ml IFNα behandel.Flo-1-selle het vroeë induksie van pSTAT1 en IRF1 getoon, wat 2 uur na behandeling begin het en vir 72 uur voortgeduur het, met 'n tydafhanklike afname in stilstaande vlakke van IRF1 (Figuur 1A).Daar is gevind dat ISG's (MX1, IFITM1, OAS1/2 en ISG15) sterk geïnduseer word na 6 uur, wat die klassieke middel- en laatfasereaksies op IFNα naboots (Figuur 1A).Saam dui hierdie data daarop dat hierdie sellulêre model gebruik kan word om interferonreaksies te bestudeer.
Differensiële proteïen uitdrukking reaksies in Flo-1 selle na IFNα behandeling.(A) Proteïenuitdrukking in Flo-1-selle wat vir 2, 6, 24, 48 en 72 uur met 10 ng/ml IFNα behandel is, is deur immunoblot ontleed deur die aangeduide ISG-teenliggaampies te gebruik.(B) Coomassie blou gekleurde SDS-PAGE gels van heelsel ekstrakte na kruisbinding met DSS vir aangeduide tye en konsentrasies.(C) Verteenwoordigende immunoblot ondersoek met p53(DO-1) teenliggaampies van dieselfde monsters om die graad van proteïen-kruisbinding te bepaal.
Om die in situ proteïen interaksie landskap vas te vang, het ons DSS gebruik, 'n wyd gebruikte kruisbindingsmiddel as gevolg van sy hoë membraan deurlaatbaarheid en relatief kort reaksie tyd.Die korter reaksietyd help om die vorming van groot aggregate van verknoopte proteïene te voorkom en sodoende die stabiliteit van die kruisbinder te behou.Om die optimale DSS-konsentrasie te bepaal en oorkruisbinding te vermy, het ons eers die selle aan 5, 2.5 en 1 mM DSS vir onderskeidelik 5, 10, 5 en 30 minute blootgestel en die lysate deur Coomassie-gekleurde SDS-PAGE ontleed. (data nie getoon nie).Sellisate blyk hoogs gekruis te wees by die laagste konsentrasie en op die kortste tydspunt.Daarom is DSS oor 5 minute tot 1, 0,5 en 0,1 mM getitreer (Figuur 1B).Optimale kruisbinding is waargeneem met 0.5 mM DSS vir 5 minute, en hierdie toestande is gekies vir selle wat met IFNα behandel is.Daarbenewens toon Figuur 1C 'n Western klad wat uitgevoer is met behulp van die p53 (DO-1) teenliggaam om die graad van proteïen-kruisbinding te bepaal.
Flo-1-selle is vir 24 uur met 10 ng/ml IFNα behandel voordat die kruisbinder bygevoeg is.Kruisgekoppelde selle is daarna gelys deur twee-stap proteolise en proteïene is verwerk deur FASP (Fig. 2)24,25.Kruisgekoppelde triptiese peptiede is deur massaspektrometrie ontleed (Fig. 2).Die MS/MS-spektra word dan by die proteïenvolgorde aangepas en met MaxQuant26,27 gekwantifiseer.Kruisgekoppelde peptiede is geïdentifiseer vanaf die verkrygde spektra met behulp van die SIM-XL-program, en individuele verbindings is gekombineer in 'n komplekse netwerk met behulp van die xQuest28 en SIM-XL29 oopbron rekenaarsagteware pyplyne (Fig. 2).SIM-XL identifiseer proteïen-proteïen-interaksies, interne kettings en individuele kettings in eenvoudige of komplekse proteïenmengsels en verskaf skrifte om interaksies in proteïenstrukture te visualiseer.Daarbenewens rangskik dit elke kruisverwysing as 'n ID-telling volgens die MS/MS29-spektrumkwaliteit.Verskeie hoogs betroubare proteïen-proteïen interaksies en komplekse is geïdentifiseer, en 'n nuwe stel interaksies is verder ondersoek deur gebruik te maak van ko-immunopresipitasie en konformasie veranderinge van komplekse deur gebruik te maak van molekulêre dinamika (MD) modellering (Fig. 2) 30, 31.
Skematiese oorsig van die CLMS-metode.Flo-1 selle is behandel met 10 ng/ml IFNα vir 24 uur gevolg deur in situ proteïen kruisbinding deur gebruik te maak van DSS gevolg deur sellise en tripsinisering.Kruisgekoppelde monsters is ontleed met 'n Orbitrap-massaspektrometer en verder gemonster vir fragmentasie van peptiedvoorlopers tydens LC-MS/MS.Twee gekoppelde peptiede is geïdentifiseer uit die verkrygde spektra deur die Spectrum Recognition Machine van die Crosslinked Peptides (SIM-XL) program te gebruik, en alle verbindings is gekombineer in 'n komplekse netwerk deur gebruik te maak van berekeningspyplyne.Filter lae vertroue interaksies uit gebaseer op vals positiewe koers (FDR) tellings.Verskeie nuwe hoë-getrouheid proteïen-proteïen interaksies is verder bevestig deur gebruik te maak van ko-immunopresipitasie, en konformasie veranderinge in die komplekse is ondersoek deur gebruik te maak van molekulêre dinamika (MD) modellering.
'N Totaal van ~ 30.500 en ~ 28.500 peptiede is opgespoor met behulp van MaxQuant in ongestimuleerde en gestimuleerde IFNα monsters, onderskeidelik (Aanvullende Tabel S1, Fig. 3A).Die peptiedlengteverspreiding in beide gevalle het 'n hoër proporsie groter peptiede getoon, wat die teenwoordigheid van kruisgekoppelde peptiede aandui (Fig. 3B,C).Daarbenewens was 'n groter deel van groter peptiede teenwoordig in die 40-55 reeks in IFNα-behandelde monsters (Fig. 3C).Proteïenkartering teen log2-intensiteit het getoon dat klassieke interferon-gestimuleerde proteïene die volopste was in vergelyking met onbehandelde monsters, insluitend MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 en HLA-F (Figuur 3D).Analise van paaie vir proteïene wat meer as drie keer verryk is in reaksie op IFNα-behandeling met behulp van die Reactome-wegdatabasis het getoon dat MHC-I-gemedieerde antigeenaanbieding en -prosessering die mees dominante roete was (Figuur 3E).In ooreenstemming met vroeëre verslae, was antivirale response bemiddel deur OAS en ISG15 sowel as IFNα/β en sitokiensein van die weë wat geaktiveer is.Daarbenewens is lisien- en serien-spesifieke proteïen-kruisbindings geïdentifiseer vanaf die oorspronklik verkrygde MS/MS-spektra met behulp van SIM-XL.'n Onlangse studie het 104 ISG's gerapporteer wat oor 20 virusse uit 9 virusklasse strek deur meta-analise van individuele ISG-ooruitdrukkingstudies in 5 seltipes9.Om egter die berekeningsbeperkings van die sifting van groot datastelle te oorkom, het ons begin met 'n kleiner datastel om moontlike interaksies tussen die lys IRDS-gene wat deur Padaria et al. gerapporteer is, te ondersoek, waarvan die meeste ISG's is.
Identifikasie van differensieel uitgedrukte kruisgekoppelde proteïene in reaksie op IFNα (data verkry vanaf MaxQuant).(A) Venn-diagram wat die aantal algemene en eksklusiewe peptiede verteenwoordig wat in IFNα14-behandelde en onbehandelde Flo-1-monsters geïdentifiseer is.Peptiedlengteverspreiding van onbehandelde (B) en IFNα-behandelde (C) verknoopte monsters.(D) Hittekaart wat log2 (LFQ-intensiteit) tussen onbehandelde en IFNα14-behandelde Flo-1-selle voorstel.Die linkerpaneel toon die proteïene wat die meeste aktief geaktiveer is in die teenwoordigheid van IFNα.(E) Histogram wat die 20 belangrikste verrykingsweë na IFNα-behandeling verteenwoordig.Die Reactome-wegdatabasis het meer as viervoudige veranderinge in opgereguleerde IFNα-responsiewe proteïene ontleed.
Interferon-gemedieerde ISG-stimulasie is goed gedokumenteer, maar op molekulêre vlak word dit swak verstaan ​​hoe hierdie proteïene kulmineer in 'n wye reeks biologiese funksies.Ons het proteïeninteraksies met 'n hoë mate van vertroue tussen bekende ISG's ondersoek.Interessant genoeg het ons 'n netwerk geïdentifiseer wat MX1-, USP18-, ROBO1-, OAS3- en STAT1-proteïene insluit wat 'n groot kompleks vorm in reaksie op IFNα-behandeling (Figuur 4, Tabel S2) 32,33,34.Die belangrikste is dat hierdie interaksies gevind is in alle drievoude behandel met IFNα en is nie gevind in onbehandelde monsters nie, wat daarop dui dat hulle spesifiek gevorm is in reaksie op IFNα behandeling.Dit is bekend dat STAT1 die uitdrukking van hierdie ISG's transkripsie reguleer, maar die interaksie daarvan met ISG's op die proteïenvlak is nie bestudeer nie.Die kristalstruktuur van STAT1 het getoon dat sy heliese domein (CCD) nie betrokke is by die interaksie met DNA of protomere tydens die vorming van dimere35 nie.Hierdie α-helikse vorm 'n heliese heliksstruktuur wat 'n oorwegend hidrofiele oppervlakte bied vir interaksies om te voorkom 35 .In ons CLMS-data het ons opgemerk dat die meeste van die interaksies met STAT1 plaasgevind het in die SH2-domein wat die CCD, die koppeldomein of die C-terminale stert (residu 700-708) voorafgaan (Figuur 4A).'n Vorige studie het gerapporteer dat USP18 aan die CCD en DNA-bindende domein (DBD) van STAT2 bind en gewerf word na die subeenheid van die tipe I interferon reseptor IFNAR2 om inhibisie van tipe I interferon sein 24 te bemiddel.Ons data het ook getoon dat die USP18-katalitiese domein in wisselwerking is met STAT1 DBD (Figuur 4A,D), wat daarop dui dat beide STAT1 en STAT2 'n rol kan speel om USP18 na IFNAR2 te lok.
Proteïen-proteïen ISG-netwerk geïdentifiseer in kruisgekoppelde selle wat met IFNα behandel is.(A) 2D-interaksie-plot wat proteïen-proteïen-interaksies toon (gegenereer in die SIM-XL-program), met lyne wat intermolekulêre interaksies voorstel (kruisskakelafsnypunt ingestel op 3.5).Domeine van verskillende identiteite word gemerk deur hul kleur32: MX1-domein, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) en GED (569–660).OAS3-domeine: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) en OAS1_C (903-108).Domein ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) en fn3 (777–864).STAT1-velde: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), en STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Sirkelvormige kyker van kruisgekoppelde proteïene (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 en STAT1) met interaksies en interaksies gemerk in blou en rooi, onderskeidelik.Die kruisskakeldrempel is op 3.5 gestel.Kolpunte dui STAT1-interaksieplekke met MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) en OAS3 (F) aan, sowel as K- of S-interaksieplekke tussen die twee peptiede.In die figuur is die kruisskakeltellingsdrempel op 3.0 gestel.(G) Verskeie interaksie-terreine tussen STAT1 en OAS3 DI-domeine gesuperponeer op hul proteïenstrukture in PyMol (PyMOL molekulêre grafiese stelsel, weergawe 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) en OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
Twee isovorme van USP18 is in mense beskryf, 'n vollengte proteïen wat oorwegend in die kern geleë is, en 'n isovorm sonder 'n N-terminale domein, USP18-sf, wat eweredig in die sitoplasma en kern 36 versprei is.Daarbenewens is voorspel dat die N-terminus ongestruktureerd is en vereis nie isopeptidase-aktiwiteit of ISG1537-binding nie.Die meeste van die interaksies wat in ons studie geïdentifiseer is, was by die N-terminus van die proteïen geleë, wat daarop dui dat hierdie interaksies vollengte USP18 (Figuur 4A,D) behels en dus waarskynlik in die kern voorkom.Boonop dui ons data ook aan dat die N-terminus gespesialiseerd is vir proteïen-tot-proteïen-interaksies.Die IFNAR2-bindingsplek is geleë tussen residue 312-368, en veral nie een van die proteïene in die kompleks bind aan hierdie streek (Fig. 4A) 37,38 nie.Hierdie data saamgeneem dui aan dat die IFNAR2-bindingsdomein uitsluitlik deur die reseptorproteïen gebruik word.Daarbenewens is gevind dat slegs OAS3 en ROBO1 geassosieer word met domeine stroomop van die N-terminus en IFNAR2 bindingsplek (Figuur 4A).
ROBO1 behoort aan die immunoglobulien (Ig) superfamilie van transmembraan seinmolekules en bestaan ​​uit vyf Ig domeine en drie fibronektien (Fn) domeine in die ekstrasellulêre gebied.Hierdie ekstrasellulêre domeine word gevolg deur 'n membraan-proksimale gebied en 'n enkele transmembraanheliks 39. 'n Ongestruktureerde intrasellulêre gebied is geleë by die C-terminus en bevat gekonserveerde volgordemotiewe wat effektorproteïenbinding bemiddel39.Die gebied wat strek van aminosure ~1100 tot 1600 is meestal wanordelik.Ons het gevind dat MX1 interaksie het met ROBO1 deur Ig, Fn en intrasellulêre domeine, terwyl die meeste interaksies met STAT1 plaasvind tussen sy CCD, koppeldomein en die C-terminus van ROBO1 (Fig. 4A, E).Aan die ander kant is interaksies met DI, DIII en OAS3 koppelstreke deur die ROBO1-proteïen versprei (Fig. 4A).
Die oligoadenilaat sintase (OAS) proteïenfamilie aanvaar en bind intrasellulêre dubbelstring-RNA (dsRNA), ondergaan konformasieveranderinge en sintetiseer 2',5'-gekoppelde oligoadenilate (2-5 As) 40 .Daar is gevind dat onder die drie OAS'e, OAS3 die hoogste affiniteit vir dsRNA vertoon en die minste hoeveelheid 2-5 As sintetiseer, wat RNase L kan aktiveer en daardeur virale replikasie 41 kan beperk.Die OAS-familie bestaan ​​uit polimerase beta (pol-β)-agtige nukleotied-transferase-domeine.Vorige navorsing het getoon dat die katalitiese aktiwiteit van die C-terminale domein (DIII) afhanklik is van die dsRNA-bindende domein (DI), wat nodig is vir die aktivering van OAS342.Ons het waargeneem dat die DI- en DII-domeine van OAS3 interaksie het met CCD en 'n klein aansluitingsgebied tussen SH2 en STAT1 TAD (Figuur 4A,F).Deur verskillende kruisbindingsplekke op die proteïenstruktuur te bedek, het 'n interaksie tussen die β-vel en DBD STAT1-lus en 'n oop sak of holte gevorm deur residue 60-75 in die DI-domein van OAS3 (Fig. 4G) geopenbaar.Die oriëntasie van die proteïene in die kompleks het ook aangedui dat geen van die interaksies met OAS3 inmeng met die DNA-bindingsvermoë van sy DI-domein nie (Fig. S1A).Daarbenewens het die N-terminale domein van GTPase MX1 omvattend interaksie met die DI en DIII domeine van OAS3 (Fig. 4A).Ons het ook 'n interaksie tussen OAS1 en MX1 in al drie IFNα-behandelde herhalings waargeneem, waar 'n enkele OAS1-domein (ook katalisties aktief) met al drie MX1-domeine in wisselwerking was (Figuur S2A,B).
MX-proteïene is deel van 'n groot familie van dineïenagtige GTPases wat 'n N-terminale GTPase-domein bevat wat GTP bind en hidroliseer, 'n intermediêre domein wat selfsamestelling bemiddel, en 'n C-terminale leucine-ritssluiter wat as 'n GTPase optree (LZ) ).domein effektor domein25,43.MX1 bind aan subeenhede van virale polimerases om transkripsie van die virale geen43 te blokkeer.'n Voorheen gerapporteerde gis twee-hibriede skerm het getoon dat PIAS1-geassosieerde MX1 STAT1-gemedieerde geenaktivering inhibeer deur DNA-bindende aktiwiteit te blokkeer en ook SUMO E344,45 ligase aktiwiteit het.Hier demonstreer ons dat MX1 aan STAT1 bind (Figuur 4C, D), maar hoe hierdie interaksie STAT1-gemedieerde geenaktivering in reaksie op IFNα beïnvloed, moet verder bestudeer word.Daarbenewens het ons ook gevind dat MX1 interaksie het met IFIT3 en DDX60 in al drie IFNα-behandelde herhalings (Fig. S2C).
DDX60 is 'n IFN-geïnduseerde sitoplasmiese helikase wat voorheen gerapporteer is om 'n rol te speel in RIG-I-onafhanklike afbraak van virale RNA46.Dit tree in wisselwerking met RIG-I en aktiveer die seinering daarvan op 'n ligand-spesifieke wyse 46. DDX60 bestaan ​​uit 'n DEXD/H-Box-helikase-domein en 'n C-terminale helikase-domein wat virale RNA en DNA47 bind.Die meeste van sy interaksies met MX1 en IFIT3 vind plaas binne lang N- en C-terminale streke sonder kanoniese domeine of motiewe (Fig. S2E,F).MX1 word egter ook geassosieer met die DEXD/H-Box-helikase-domein (Fig. S2E).Proteïene van die IFIT-familie het tandem-kopieë van 'n kenmerkende heliks-draai-heliks-motief wat die tetrapeptied-herhaling (TPR) genoem word.Daar is gevind dat IFIT3 'n positiewe modulator van RIG-I sein is en dus 'n komponent van die MAVS kompleks.Saam saam stel ons data voor dat IFIT3 en DDX60 hoofsaaklik in die streek tussen TPR 3-6 van IFIT3 interaksie het en 'n rol kan speel in RIG-I/MAVS-sein (Fig. S2F).
Aangesien die sifting van die hele proteoom rekenkundig intensief is, het ons dan die hele menslike UniProt-databasis gekeur vir die teenwoordigheid van een van die IFNα-behandelde herhalings.In hierdie replika het ons verskeie hoogs betroubare interaksienetwerke vir HLA-A gevind.Ontleding van proteïenbane wat deur MS/MS-spektra geïdentifiseer is, het getoon dat MHC-I-gebaseerde antigeenverwerking en aanbieding die hoofweg is wat deur interferon geïnduseer word (Fig. 3D).Daarom het ons daarop gefokus om die proteïeninteraksies van MHC-I-molekules met 'n hoë mate van vertroue in alle kruisgekoppelde monsters te bestudeer.HLA bestaan ​​uit α1, α2 en α3 domeine en ligte kettings, en mikroglobulien β2 (β2m) is 'n konstante chaperone proteïen49.Sodra dit in die endoplasmiese retikulum saamgestel is, is HLA onstabiel in die afwesigheid van peptiedligande50.Die peptied-bindende groef word gevorm deur die hoogs polimorfiese en ongestruktureerde α1- en α2-domeine in nie-peptiedvorm en die relatief minder polimorfiese α351-domein.In die teenwoordigheid van IFNα het ons twee HLA-A-komplekse opgespoor: een is in wisselwerking met HMGA1 en H2B (Figuur 5, Tabel S3) en die ander in wisselwerking met MDN1, LRCH4 en H2B (Figuur 6).
IFNα induseer 'n HLA-A interaksie netwerk met H2B (H2BFS) en HMGA1.(A) 2D-plot (gegenereer in SIM-XL-sagteware) wat verskillende tipes interaksies in die H2B-HLA-A-HMGA1-kompleks uitbeeld: tussenskakel (blou), tussenskakel (rooi) en enkelskakel (swart)..Domeine van verskillende identiteite is kleurgekodeer32: H2B (histone; 2–102) en MHC-I (MHC_1; 25–203, groep C1; 210–290 en MHC_I_C; 337–364).Die kruisskakeldrempel is op 3.5 gestel.Kolpunte dui HLA-A-interaksieplekke met H2B (B) en HMGA1 (C) aan, sowel as K- of S-interaksieplekke tussen die twee peptiede.In die figuur is die kruisskakeltellingsdrempel op 3.0 gestel.(D) Verwantskappe tussen proteïene wat in die strukture van die H2B-, HLA-A- en HMGA1-proteïene in die PyMOL-program getoon word.Hierdie strukture is gemodelleer deur gebruik te maak van die Phyre2-bediener (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) en die sjabloonstrukture vir die H2B, HLA-A en HMGA1 proteïene was onderskeidelik 1kx552, 1kj349 en 2eze55.
IFNα induseer 'n HLA-A interaksie netwerk met H2B (H2BFS), MDN1 en LRCH4.(A) Intramolekulêre (rooi) en intermolekulêre (blou) kruisbindings aangebied op 'n 2D interaktiewe kaart (gegenereer in SIM-XL sagteware) met MDN1 voorgestel as 'n sirkel.Die kruisskakeldrempel is op 3.5 gestel.Domeine van verskillende identiteite is kleurgekodeer32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, groep C1; 210–290 en MHC_I_C; 337–364) en LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) en CH (535–641)).(B) Verwantskappe tussen proteïene getoon in die strukture van die H2B, HLA-A, LRCH4 en MDN1 proteïene in die PyMOL program.Hierdie strukture is gemodelleer deur gebruik te maak van die Phyre2-bediener (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) met sjabloonstrukture 1kx552, 1kj349, 6hlu62 en 6i2665 vir die H2B, HLA-A, LRCH4 en MDN1 proteïene, onderskeidelik.Kolpunte wat K- of S-interaksieplekke vir HLA-A met H2B (C), LRCH4 (D) en MDN1 (E) toon.Vir erwe is die kruisskakeltelling-drempel op 3.0 gestel.
Benewens die handhawing van die integriteit van die genoom, is histoon H2B ook betrokke by die regulering van transkripsie.Die H2B-proteïen bestaan ​​uit 'n sentrale histoondomein (HFD) wat gevorm word deur drie α-helikse geskei deur lusse en 'n C-terminale stert 41,52.Die meeste van die interaksie met H2B vind plaas in die α1-heliks, wat trimerisasie met die HFD-heterodimeer verskaf (Fig. 5A,B).Alhoewel lisiene betrokke is by DNA-binding, is sommige lisiene ook alternatiewe asetilerings- of metileringsplekke.Byvoorbeeld, residue K43, K46 en K57 van H2B is nie betrokke by direkte DNA-binding nie, maar is teikens van verskeie post-transkripsionele modifikasies53.Net so kan residue K44, K47 en K57 in H2B 'n alternatiewe rol speel in die teenwoordigheid van IFNα, insluitend interaksies met ander proteïene (Fig. 5A, B).Daarbenewens aktiveer die ekstrachromosomale histoon H2B die immuunrespons in verskeie seltipes, wat as 'n sitosoliese sensor optree om dubbelstring-DNS (dsDNA)-fragmente wat afkomstig is van aansteeklike middels of beskadigde selle op te spoor54.In die teenwoordigheid van DNA-virusse het H2B-uitputting IFN-β-produksie en STAT154-fosforilering geïnhibeer.Dit is ook bekend dat H2B vinniger in en uit die kern beweeg as ander kernhistone54.H2B interaksies met MDN1 en LRCH4 is ook waargeneem in geselekteerde onbehandelde monsters.Ons het gevind dat HLA-A interaksie het met H2B in al drie IFNα-behandelde monsters en in een onbehandelde herhaalmonster.Hierdie data weerspieël die rol van H2B in 'n alternatiewe fisiologiese funksie onafhanklik van transkripsionele regulering.
HMGA1 (hoë mobiliteit groep AT-Hook 1), 'n klein nukleoproteïen ryk aan siekte-bevorderende aminosure, is geïdentifiseer in samewerking met HLA-A.Dit het 'n suur C-terminale stert en drie duidelike DBD's wat AT-hake genoem word omdat hulle aan die klein groef van die AT-ryke streek in dsDNA55,56 bind.Hierdie binding veroorsaak dat die DNS buig of reguit maak, wat kanoniese transkripsiefaktore toegang gee tot die konsensusvolgorde daarvan.Daar word geglo dat die C-terminale stert betrokke is by proteïen-proteïen interaksies en die werwing van transkripsiefaktore, aangesien C-terminale delesiemutante nie in staat is om transkripsie te inisieer nie57.Boonop bevat hierdie domein verskeie bewaarde fosforileringsplekke wat bekende substrate vir kinases 58 is.Ons het HLA-A en H2B interaksies met HMGA1 buite die C-terminale domein waargeneem, wat daarop dui dat die C-terminale domein hoofsaaklik gebruik word vir transkripsiefaktorbinding (Fig. 5A, C).HMGA-proteïene kompeteer met histoon H1 vir binding aan adapter-DNA, en verhoog daardeur toeganklikheid57.Net so lyk dit waarskynlik dat HMGA interaksie het met histoon H2B langs die koppel-DNS in kompetisie met histoon H1.HMGB1 induseer die uitdrukking van HLA-A, -B en -C in dendritiese selle, wat lei tot hul aktivering59, maar 'n interaksie tussen HMG en HLA is nie voorheen gerapporteer nie.Ons het gevind dat HMGA1 interaksie het met die α1 en α3 domeine van HLA-A, met die meeste van die interaksies buite sy 3 DBD (Figuur 5A,C).In ons hande is gevind dat HLA-A in die kern gelokaliseer is (data nie getoon nie), en gegewe dat H2B en HMGA1 ook in die kern teenwoordig is, vind hierdie interaksie waarskynlik in die kern plaas.Spesifieke addukte gemeet tussen H2B, HLA-A en HMGA1 word in Figuur 5D getoon.
Die meeste interaksies van HLA-A met ander proteïene vind plaas binne sy α1- en α2-domeine en die ongeordende C-terminale domein (Fig. 6).In een van hierdie voorbeelde het ons gevind dat HLA-A interaksie het met die wanordelike N-terminale stert van LRCH4 (Figuur 6A,D).LRCH4 reguleer TLR4-aktivering en LPS-sitokieninduksie, waardeur die aangebore immuunrespons gemoduleer word60,61.Dit is 'n membraanproteïen met nege leusienryke herhalings (LRR'e) en 'n kalmodulien (CH) homologiemotief in sy ektodomein, gevolg deur 'n transmembraandomein (TMD) 60, 62.Daar is gerapporteer dat CH-domeine proteïen-proteïen-interaksies bemiddel 60.'n Strek van ongeveer 300 aminosure tussen die LRR- en CH-domeine is relatief toeganklik maar wanordelik.Gebaseer op die funksie van wanordelike streke as bemiddelaars van proteïen-proteïennetwerke en vesikulêre vervoer 63, het ons gevind dat die meeste proteïeninteraksies in wanordelike streke voorkom.Interaksies met MDN1 is oor die lengte van die proteïen versprei, insluitend die LRR1, LRR6, CH-domeine en ewekansige streke, terwyl H2B hoofsaaklik aan die CH-domein gebind het (Fig. 6A, B).Opmerklik, geen van die interaksies het die TMJ ingesluit nie, wat die spesifisiteit van die CLMS-benadering voorstel (Figuur 6A, B).
MDN1 is ook geïdentifiseer as deel van die HLA-A-proteïennetwerk (Figuur 6A).Dit behoort aan die AAA-familie van proteïene (ATPases wat met verskillende aktiwiteite geassosieer word).Dit is dieselfde N-terminale AAA-domein wat in 'n heksameriese ring organiseer en die samestellingsfaktor van die 60S 64 ribosomale subeenheid verwyder.blyk soortgelyk aan dynein64,65,66 te wees.Daarbenewens word die Asp/Glu-ryke streek gevolg deur die MIDAS-domein (metaalioon-afhanklike plek).Weens die groot grootte van MDN1 (ongeveer 5600 aminosure) en sy beperkte homologie met goed bestudeerde proteïene, is min bekend oor die struktuur en funksie daarvan by mense.Ons het HLA-A, H2B en LRCH4 as MDN1-bindingsvennote geïdentifiseer en hul oriëntasie as proteïenkomplekse in PyMol geopenbaar (Fig. 6A, B).Hierdie drie proteïene is in wisselwerking met die AAA-domein, die dineïen-agtige skakeldomein, en moontlik die MIDAS MDN1-domein.In 'n vorige verslag het affiniteitsuiwering van aasproteïene MDN1 geïdentifiseer as 'n proteïen wat met histoon H2B67 geassosieer word.Daarbenewens het 'n onlangse studie ook 'n interaksie tussen MDN en HLA-B in HCT116-selle gerapporteer met behulp van affiniteit-gesuiwerde massaspektrometrie, wat ons bevindings ondersteun68.Die identifikasie van hierdie kompleks in IFNα-behandelde monsters dui op 'n rol vir MDN1 in interferon sein.
Omdat HLA-gene hoogs polimorf is, het ons opeenvolgingslesings wat HLA-A, -B en -C karteer uit RNA-volgordebepalingsdata van Flo-1-selle onttrek (data nie getoon nie).Peptiedvolgordes in ooreenstemming met die volgordebepalinglesing het beduidende verskille tussen HLA-A, -B en -C geopenbaar in streke waar kruisgekoppelde peptiede in HLA-A geleë was (Figuur S3).Daarbenewens het ons nie proteïen-tot-proteïen-kruisbinding van HLA-B/C-molekules met H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4-proteïene waargeneem nie.Dit dui daarop dat die proteïeninteraksie tussen HLA-A, MDN1, LRCH1 en HMGA1 HLA-A-spesifiek is.Daarbenewens het proteomiese analise van nie-verknoopte monsters (Tabel S4) getoon dat HLA-A 'n hoër volgorde dekking het in vergelyking met HLA-B of HLA-C.Die peptiede wat vir HLA-A geïdentifiseer is, was hoog in intensiteit in beide IFNα-behandelde en onbehandelde monsters.
Om te verseker dat die interaksies wat hier geïdentifiseer is nie te wyte was aan nie-spesifieke kruisbinding van twee proteïene in die nabye ruimtelike nabyheid nie, het ons verder twee nuwe HLA-A-interaksiefaktore bevestig deur ko-immunopresipitasietoetse uit te voer.HLA-A-interaksies met endogene MDN1 en H2B is opgespoor in beide IFNα-behandelde en onbehandelde Flo-1-selle (Figuur 7, Figuur S4).Ons het bevestig dat HLA-A deur H2B in die immunopresipitate vasgevang is en dat hierdie assosiasie te wyte was aan IFNα-behandeling aangesien HLA-A afwesig was in die immunopresipitaatmonsters van onbehandelde selle (Figuur 7A).Ons data dui egter daarop dat IFNa differensieel HLA-A-binding aan H2B en MDN1 reguleer.IFNα induseer assosiasie tussen H2B en HLA-A, maar verminder die assosiasie met MDN1.Ons het gevind dat MDN1 geassosieer is met HLA-A in kontroles, en die byvoeging van IFNα het hierdie interaksie verminder onafhanklik van MDN1 induksie deur IFNα (Figuur 7B, C).Daarbenewens HLA-A immunopresipitasie gevang H2B in A549 selle (Fig. S4), wat daarop dui dat hierdie interaksie is onafhanklik van sel tipe.Saamgevat ondersteun hierdie resultate interferon-gemedieerde interaksies van HLA-A met H2B en MDN1.
HLA-A co-suiwer H2B en MDN1.Verteenwoordigende endogene H2B (A) en MDN1 (B) immunoblots is immuungepresipiteer vanaf IFNα-behandelde Flo-1 selle en ondersoek vir die aangeduide teenliggaampies.Muis en konyn IgG is as 'n negatiewe kontrole gebruik.(C) Relatiewe hoeveelhede (insette) van verskillende antigene word uitgebeeld deur immunoblots wat teen aangeduide teenliggaampies ondersoek is, β-aktien is as 'n laaikontrole gebruik.
Die strukturele eienskappe van een van die interferon-geïnduseerde hoogs betroubare kruisgekoppelde netwerke, H2B-HLA-A-HMGA1, is ondersoek.Ons het molekulêre dinamika-modellering as 'n alternatiewe benadering gebruik om die konformasiedinamika van die proteïene betrokke by hierdie kompleks te verstaan ​​(Figuur 8).Afleidings uit die CLMS-data dui op die moontlikheid van verskillende konformasies van die H2B-, HLA-A- en HMGA1-proteïene.Daarom is die volgende potensiële komplekse in 'n oplosmiddelmedium gemodelleer: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A en H2B-HLA-A-HMGA1.'n Aanvanklike proteïen-proteïen koppelskerm wat die MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) pakket gebruik, het moontlike konformasies voorgestel wat tussen hierdie proteïene verskil (Fig. 8A).Visualisering van die koppelproteïenkompleks het verskeie interaksies en moontlike konformasies aan die lig gebring (Figuur 5A, 8).Dus, een moontlike konformasie word in Figuur 8A getoon (met gemerkte kruisverbindings) en dit is verder geëvalueer deur gebruik te maak van die MD-modelleringspyplyn.Daarbenewens beklemtoon binding van H2B of HMGA1 aan HLA-A die hoër affiniteit van H2B vir HLA-A (Fig. 8A).
Konformasiedinamika van moontlike netwerke tussen die H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, en H2B-HLA-A-HMGA1 komplekse.(A) Linkerpaneel is 'n 2D-kaart (gegenereer in SIM-XL-sagteware) van intramolekulêre (rooi) en intermolekulêre (blou) kruisbindings (kruisskakelafsnypunt ingestel op 3.5).Boonop word kruisbindende residue wat geïdentifiseer is, gemerk op die strukture van die H2B, HLA-A en HMGA1 proteïene.Die geassosieerde konformasies van hierdie proteïene is onttrek met behulp van die dokpyplyn wat in die MOE-pakket geïmplementeer is.Die onderste linkerpaneel toon die verskeie moontlike konformasies van die H2B-HLA-A- en HMGA1-HLA-A-komplekse met verskillende proteïen-proteïenbindingsaffiniteite (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standaardafwyking (RMSD) van atoomposisies (waterstofatome uitgesluit) vir elke proteïenstruktuur.(C) Intermolekulêre proteïen-proteïen waterstofbinding interaksies van verskeie gesimuleerde komplekse met inagneming van spesifieke interaksies van duur ≥ 10 ns.Die h-binding skenker-aanvaarder afsnyafstand is gestel op 3.5 Å, en die skenker-H-akseptor afsnyhoek is gestel op ≥ 160°–180°.(D) Gemerkte oorblyfsels wat HLA-A proteïen-proteïen interaksies met hul onderskeie vennote vorm, wat strek oor ≥ 20 ns, onttrek uit dummy HLA-A-H2B en HLA-A-HMGA1 komplekse.Proteïenstrukture verteenwoordig 'n gemiddelde struktuur van 100 ns MDS.(E) Interaksies tussen HLA-A-H2B en HLA-A-HMGA1 komplekse in vergelyking met interaksies opgespoor deur H2B-HLA simulasie oor 100 ns gebaseer op die K of S interaksie plek tussen die twee peptiede.Komplekse /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Die drempelwaarde vir die evaluering van kruisskakels is op 3.0 gestel, en spesifieke interaksies vanaf MDS wat ≥ 10 ns neem, is in ag geneem.Proteïenstrukture is gevisualiseer deur gebruik te maak van BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, VSA) en Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) pakkette.
Die stabiliteit van HLA-A molekules oor tyd (standaardafwyking; RMSD of standaardafwyking; RMSF) het aangedui dat die teenwoordigheid van H2B of HMGA1 proteïene in die komplekse HLA-A gestabiliseer het (Figuur 8B, Figuur S5).Die HMGA1-proteïen bind styf aan die B2M-plek van HLA-A, wat die stabiliteit van die HLA-A-aminosure in die HLA-A-HMGA1- of H2B-HLA-A-HMGA1-kompleks induseer (Figuur 8B, Figuur S5).daar is veral gevind dat HLA-reste ~60-90 en ~180-210 minder buigsaam is in die teenwoordigheid van H2B (FIG. 8B).H2B en HMGA1 het beter binding aan HLA-A in die H2B-HLA-A-HMGA1 kompleks getoon in vergelyking met HLA-A binding aan H2B of HMGA1 alleen (Figuur 8C,D; Tabel S5).Residu betrokke by waterstofbinding (MD gemodelleer hoë besetting ≥ 10 ns) val saam met CLMS interaksie terreine (K of S residue) in die kompleks, wat daarop dui dat die interaksies geïdentifiseer deur CLMS baie betroubaar is.Betroubaarheid (Fig. 8E).In CLMS- en MD-modellering is gevind dat HLA-A-reste tussen ongeveer 190-210 en ongeveer 200-220 aminosure onderskeidelik H2B en HMGA1 bind (FIG. 8E).
Proteïen-proteïen interaksies vorm dinamiese strukturele netwerke wat intrasellulêre kommunikasie bemiddel in reaksie op sekere stimuli.Omdat baie proteomika-benaderings veranderinge in die algehele bestendige toestandvlak van 'n proteïen opspoor, vereis proteïen-proteïeninteraksiedinamika bykomende gereedskap om bindingskoppelvlakke vas te lê, en CLMS is een so 'n instrument.Die interferon-seinstelsel is 'n sitokiennetwerk wat selle in staat stel om op 'n reeks omgewingspatogeniese en intrinsieke patologiese seine te reageer, wat uitloop op die induksie van subsets van interferon-induseerbare proteïene.Ons het CLMS toegepas om te bepaal of nuwe proteïen-proteïen-interaksies tussen 'n paneel van interferon-geïnduseerde proteïene geïdentifiseer kan word.Globale proteïen-kruisbindingsanalise in 'n interferon-responsiewe Flo-1-selmodel is gebruik om proteïenkomplekse vas te vang.Onttrekking van tryptiese peptiede uit nie-kruisgekoppelde en kruisgekoppelde selle maak voorsiening vir peptiedtelling, padverryking en peptiedlengteverspreiding met gedefinieerde LFQ-intensiteit.Kanoniese interferon-induseerbare proteïene is as 'n positiewe interne kontrole geïdentifiseer, terwyl nuwe intermolekulêre en intramolekulêre kruisgebonde addukte van kanoniese interferon-induseerbare proteïene soos MX1, UP18, OAS3 en STAT1 waargeneem is.Verskeie strukturele kenmerke en interaksies in funksionele areas is ondersoek.
'n Interaksie tussen HLA-A, MDN1 en H2B is opgespoor deur immunoblotting in Flo-1 en A549 selle wat met IFNα behandel en onbehandel is.Ons resultate beklemtoon dat HLA-A komplekse met H2B op 'n IFNα-afhanklike wyse.Ons werk verteenwoordig 'n interessante weg vir verdere verkenning van die mede-lokalisering van hierdie twee komplekse.Dit sal ook interessant wees om die CLMS-benadering uit te brei na 'n paneel sellyne om seltipe-onafhanklike interferon-gemedieerde proteïeninteraksies te identifiseer.Laastens het ons MD-modellering as 'n alternatiewe benadering gebruik om die konformasiedinamika van proteïene betrokke by die H2BFS-HLA-A-HMGA1-kompleks te verstaan, wat intramolekulêre en intermolekulêre kruisgesprekke nagespoor het.Afleidings van die CLMS data dui op die moontlikheid van verskillende konformasies van die H2BFS, HLA-A en HMGA1 proteïene.Die moontlike verskillende konformasies tussen hierdie koppelproteïenkomplekse het verskeie interaksies geopenbaar soortgelyk aan dié wat in die CLMS-datastel waargeneem is.Een van die belangrikste sterkpunte van ons metode is dat dit maklike identifisering van interaksie hoogs polimorfiese gene soos HLA moontlik maak, so dit sal interessant wees om interaksies van HLA haplotipe-spesifieke proteïene te bestudeer wat andersins moeilik is om te bestudeer.Saamgevat demonstreer ons data dat CLMS gebruik kan word om ons begrip van interferon-geïnduseerde seinnetwerke uit te brei en 'n basis te bied vir die bestudering van meer komplekse intersellulêre stelsels in die tumormikro-omgewing.
Flo-1 selle is verkry vanaf ATCC en onderhou in DMEM (Gibco) aangevul met 1% penisillien/streptomisien (Invitrogen), 10% fetale bees serum (Gibco) en gestoor by 37°C en 5% CO2.Inkubasie.Selle is tot 70-80% samevloeiing gekweek voordat dit met IFNα14 (vervaardig deur Edinburgh Protein Production Facility) behandel is.Alle ander chemikalieë en reagense is by Sigma Aldrich gekoop, tensy anders vermeld.
Flo-1 selle is gekweek in 6-put plate en die volgende dag is die selle behandel met 10 ng/ml IFNα14 vir 24 uur tot ongeveer 80% samevloeiing.Selle is drie keer met PBS gewas en gelig met vars voorbereide DSS (Thermo Fisher Scientific) (opgelos in DMSO) in PBS vir 5 min by 37° C. tot 'n finale konsentrasie van 0.5 mM.Die DSS-kruisbindingsreaksie is vervang met PBS en oorblywende DSS is geblus deur 20 mM Tris (pH 8.0) in PBS vir 15 min by 37°C by te voeg.Selle is versamel deur skraap en versamel in lae binding buise (Axygen).
Die selkorrel is gelys met 300 µl ureum-lisisbuffer (8 M ureum, 0.1 M Tris, pH 8.5) vir 30 min by kamertemperatuur met af en toe geskud.Alle sentrifugeringstappe is uitgevoer by 14 000 xg by 8°C.Sentrifugeer die lysaat vir 10 minute en dra die supernatant oor na 'n nuwe buis.Die oorblywende helder deeltjies is opgelos in 150 μl van die tweede lisebuffer (2 M ureum, 2% (w/v) SDS (natriumdodesielsulfaat)) vir 30 minute of meer totdat 'n homogene waterige oplossing verkry is.Die lysaat is vir 20 minute gesentrifugeer en die supernatant is gemeng met die lysaat wat in die vorige stap verkry is.Proteïenkonsentrasies is geassesseer met behulp van die Micro BCA-toets (Thermo Fisher Scientific) volgens die vervaardiger se instruksies vir mikroplaatprosedures.Die monsters is vinnig in vloeibare stikstof gevries en by -80°C gestoor.
Ongeveer 100 μg oplosbare kruisgekoppelde proteïen is verwerk deur gebruik te maak van 'n gemodifiseerde filtrasiemonstervoorbereidingsprotokol (FASP) soos beskryf deur Wisniewski et al.69 Kortliks, die proteïen word met 200 µl ureumbuffer (8 M ureum in 0,1 M Tris, pH 8,5) gekruisgebind, gevorteks en gehalveer.Alle sentrifugeringstappe is uitgevoer by 14 000 xg by 25°C.Die eerste helfte van die kruisgekoppelde proteïenlisaat is oorgedra na 'n 10 kDa Microcon sentrifugale filter toestel toegerus met 'n Ultracel-10 membraan (Merck), gevolg deur sentrifugering op die filter vir 25 minute.Voeg dan die tweede helfte van die proteïen by die filter en herhaal dieselfde stappe.Proteïenherwinning is uitgevoer deur 100 μl 17 mM tris(2-karboksietiel)fosfienhidrochloried (TCEP) in ureumbuffer by te voeg.Herwinning is geroer op 'n termomenger by 600 rpm vir 30 min by 37°C.Boonop is die kolom gesentrifugeer en die gereduseerde verknoopte proteïen is alkieleer met 100 μl 50 mM joodasetamied in ureumbuffer.Die alkileringsreaksie is by kamertemperatuur vir 20 minute in die donker uitgevoer.Draai die kolom, was die kolomwande 3 keer met 100 µl ureumbuffer, en sentrifugeer dan.Dieselfde bewerking is 3 keer uitgevoer met 100 μl 100 mM ammoniumbikarbonaat.Voor tripsinisering, vervang die versamelbuis met 'n nuwe een.Voeg spysverteringbuffer by wat 50 mM ammoniumbikarbonaat en 1 µl tripsien verdun in tripsienbuffer (Promega) bevat.Die verhouding van tripsien tot proteïen is op ongeveer 1:33 gehandhaaf, en verteringreaksies is oornag by 37°C in 'n vogkamer geïnkubeer.Die verknoopte peptied is uit die filter geëlueer deur sentrifugering vir 25 minute.Peptiedherwinning is verbeter deur 50 μl 0.5 M NaCl by die filter te voeg, gevolg deur sentrifugering vir 25 minute.
C18 Micro Spin kolomme (Harvard Apparaat) is gebruik om kruisgekoppelde triptiese peptiede te ontsout volgens die protokol beskryf deur Bouchal et al.70 met geringe modifikasies.Kortliks, C18-spinkolomme is geaktiveer met drie wassings van 0.1% mieresuur (FA) in asetonitril (AcN) (Merck) en twee wassings van 0.1% FA.Die kolom is gehidreer met 0.1% FA vir 15 minute.Laai monsters in spinkolomme en was 3 keer met 0.1% FA.Die ontsoute peptiede is opeenvolgend geëlueer met 'n stapsgewyse gradiënt deur 50%, 80% en 100% AcN in 0.1% FA te gebruik.Die monsters is in 'n SpeedVac Plus-konsentrator (Eppendorf) gedroog totdat die oorblywende vloeistof heeltemal verdwyn het.Die geëlueerde peptiede is opgelos in 100 μl 0.08% trifluorasynsuur in 2.5% AcN en die konsentrasies is gemeet op 'n NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Ongeveer 1 μg van verknoopte peptied per monster is in die LC-MS/MS sisteem ingespuit.
Kruisgekoppelde peptiede is geskei op 'n UltiMate 3000 RSLCnano LC-stelsel (Thermo Scientific) gekoppel aan 'n Orbitrap Exploris 480 massaspektrometer (Thermo Scientific).Kruisgekoppelde peptiede is versamel op 'n 300 µm ID, 5 mm lange µ-pre-kolom C18 vangkolom gepak met C18 PepMap100 sorbent en 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Laai die pompvloeistel op 5 µl/min 0.08% trifluorasynsuur opgelos in 2.5% AcN.Kruisgekoppelde peptiede is geskei op 'n analitiese saamgesmelte silikakolom met 'n binnedeursnee van 75 μm en 'n lengte van 150 mm, gevul met 'n 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Mobiele fases A en B het onderskeidelik uit 0.1% FA in water en 0.1% FA in asetonitriel bestaan.Die gradiënt begin by 2.5% B en neem lineêr toe tot 40% B oor 90 minute, dan na 90% B oor die volgende 2 minute.Die mobiele fase samestelling is vir 10 minute by 90% B gehandhaaf en dan lineêr afgeneem tot 2.5% B oor 2 minute.Die kolom is vir 8 minute voor die volgende siklus by 2,5% B geëquilibreer.Kruisgekoppelde peptiede wat uit die analitiese kolom geëlueer is, is in 'n nano-elektrossproei-ionisasie (NSI) bron geïoniseer en in 'n Exploris 480 massaspektrometer (Thermo Scientific) ingespuit.
Die Orbitrap Exploris 480-massaspektrometer het in die positiewe datakorrelasiemodus gewerk.'n Volledige skandering is in seksiemodus uitgevoer teen 'n resolusie van 120 000 met reeksinstellings van m/z 350 Th tot m/z 2000 Th.Die genormaliseerde AGC-teiken is op 300% gestel met 'n maksimum insettyd van 50ms.Monoisotopiese piekopsporing is vir peptiede vasgestel.Die beperkingverslappingsparameter word op waar gestel as te min voorlopers gevind word.Die minimum ioniese sterkte van die voorloper is op 5.0e3 gestel en voorloperladingstoestande tot +8 is by die eksperimente ingesluit.
Die siklustyd tussen groot skanderings in datakorrelasiemodus is op 2.5 sekondes gestel.Dinamiese massa-uitsluiting is gestel op 20 s na die eerste fragmentasie van die voorloper-ioon.Die voorloper-isolasievenster is op 2 Th gestel.Die tipe genormaliseerde botsingsenergie met 'n vaste botsingsenergiemodus is gekies in 'n data-afhanklike MS/MS-skandering.Botsingsenergie gestel op 30%.Die Orbitrap-resolusie is op 15 000 gestel en die AGC-teiken op 100%.Die pasgemaakte maksimum inspuittyd is op 60 millisekondes gestel.
Voordat ons die proteïen-proteïennetwerk in kruisgekoppelde monsters nagespoor het, het ons die rou lêers verwerk deur die MaxQuant-pakket (weergawe 1.6.12.0)26,27 te gebruik om naspeurbare peptiede/proteïene in die monsters te identifiseer.Boonop is soortgelyke proteomiese ontledings uitgevoer op onverkruisde Flo-1 monsters wat met IFNα behandel en onbehandel is.MS/MS-data is deursoek in die UniProt-mensdatabasis (www.uniprot.org) (opgelaai op 12 Augustus 2020, bevat 75 093 inskrywings) met behulp van die ingeboude soekenjin Andromeda27.Die soektog is uitgevoer sonder om die spesifisiteit van die ensiem en verskeie modifikasies van deamidering (N, Q) en oksidasie (M) aan te dui.Voorlopermassa-toleransies is op 20 dpm gestel en produkione op 0.02 Da.Die aanvanklike en maksimum massaafwyking is op 10 dpm gestel.Die maksimum massa van die peptied is op 4600 Da gestel en die volgorde-ooreenkoms is gestel tussen 7 en 25 aminosure (aa).Verdere statistiese ontleding is uitgevoer met behulp van die Perseus-program (weergawe 1.6.10.45).Proteïeninhoud is bereken deur die spektrale intensiteit van die proteïen (LFQ-intensiteit; ongemerkte kwantifikasie)27 te normaliseer en die intensiteitswaardes is omgeskakel na Log2.'n Hiërargiese groepering van proteïene geïdentifiseer deur hul peptiedintensiteit is gebou deur die pheatmap (v1.0.12) pakket in R (v 4.1.2) te gebruik.Wegverrykingsanalise is uitgevoer met behulp van die Reactome-wegdatabasis vir IFNα-behandelde proteïene wat meer as vier keer geaktiveer was in vergelyking met onbehandelde monsters.
Identifikasie van lisien (K) of serien (S) spesifieke chemiese kruisbindings van proteïenkomplekse gemonitor deur LC-MS/MS is uitgevoer met behulp van 'n spektroskopiese identifikasie masjien (SIM-XL) vir kruisgekoppelde peptiede (SIM-XL)29.Eerstens is moontlike interaksies tussen interferon-geassosieerde (IFN) DNA-skadeweerstand-handtekening (IRDS) gene ondersoek met behulp van die IRDS-proteïendatastel wat in Padariya et al.28 beskryf word.Sifting van alle toestande en herhalings van die hele menslike UniProt is berekeningsintensief, dus die hele menslike UniProt-databasis (www.uniprot.org) (afgelaai op 12 Augustus 2020, bevat 75 093 inskrywings) teen IFNα-behandelde herhalings.Een van die filters vir hoë vertroue interaksies.Hierdie hoë-beduidende interaksies wat verkry is, is uitgebrei en getoets in alle herhalings en toestande.
In SIM-XL is DSS vir die kruisbinder (XL) gebruik en die XL-gewigverskuiwing en wysigingsgewigverskuiwing is onderskeidelik op 138.06 en 156.07 gestel.Die volgende kruisbindingsreaksieplekke word oorweeg: KK, KS en KN-TERM, sonder verslaggewerione.Beide voorloper en fragment dpm is op 20 gestel en die Xrea-drempel is op 0.15 gestel.Trypsien is as heeltemal spesifiek beskou, en 'n hoë-energie C-trap (HCD) fragmentasie metode is geïmplementeer.Die XCorr dinamiese DB reduksie drempel en die minimum aantal peptiede vir dinamiese DB reduksie is gestel op 2.5 en 2, onderskeidelik.Ander parameters is: mono-isotoop waarskynlikheid en piek toeval afsnypunt, minimum 4 AA residue per string en maksimum string lading, en 3 maksimums van gemiste splits.Die gevolglike gestikte 2D-kaarte is in (SIM-XL) ontleed en die xQuest28 grafiese voorstelling is gebruik om die 2D-kaarte te bou.Proteïen-kruisbindings op proteïenstrukture word verskaf in PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, weergawe 2.0 Schrödinger, LLC).
Proteïenmodelstrukture is geskep deur gebruik te maak van die Phyre2-bediener (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 deur die beginsels van homologiemodellering en implementering van die "Hidden Markov Method" te gebruik.Phyre2 genereer modelstrukture gebaseer op volgordebelyning met bekende proteïenstrukture.Vir H2BFS-, HLA-A-, HMGA1-, LRCH4- en MDN1-proteïene is sjabloonstrukture 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 en 6i2665 gebruik.Daarbenewens is die struktuur van AlphaFold71 MX1, UBP18 en ROBO1 ook oorweeg.Die proteïenstruktuur is gevisualiseer met behulp van die BIOVIA Discovery Studio Visualizer-pakket (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, VSA) en die Molecular Operating Environment-pakket (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).