Dankie dat jy Nature.com besoek het.Jy gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).Daarbenewens, om deurlopende ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.
Sliders wat drie artikels per skyfie wys.Gebruik die terug- en volgende-knoppies om deur die skyfies te beweeg, of die skyfiebeheerknoppies aan die einde om deur elke skyfie te beweeg.

317 Roesvrye staal spoelbuis verskaffers

Chemiese samestelling tabel van vlekvrye staal materiaal

SPACA6 is 'n sperm-uitgedrukte oppervlakproteïen wat krities is vir gameetsamesmelting tydens soogdier seksuele voortplanting.Ten spyte van hierdie fundamentele rol, word die spesifieke funksie van SPACA6 swak verstaan.Ons lig die kristalstruktuur van die ekstrasellulêre domein van SPACA6 toe teen 'n resolusie van 2.2 Å, wat 'n twee-domein proteïen onthul wat bestaan ​​uit 'n vierstrengige bondel en Ig-agtige β-toebroodjies verbind deur kwasi-buigsame skakelaars.Hierdie struktuur lyk soos IZUMO1, 'n ander gameetfusie-geassosieerde proteïen, wat SPACA6 en IZUMO1 stigterslede maak van die superfamilie van bevrugting-geassosieerde proteïene waarna hierin verwys word as die IST superfamilie.Die IST superfamilie word struktureel gedefinieer deur sy gedraaide vier-heliks bundel en 'n paar disulfied-gekoppelde CXXC motiewe.'n Struktuurgebaseerde AlphaFold-soektog van die menslike proteoom het bykomende proteïenlede van hierdie superfamilie geïdentifiseer;veral, baie van hierdie proteïene is betrokke by gameetfusie.Die SPACA6-struktuur en sy verhouding met ander lede van die IST-superfamilie verskaf die ontbrekende skakel in ons kennis van soogdiergameetfusie.
Elke menslike lewe begin met twee afsonderlike haploïede gamete: die vader se sperm en die moeder se eiersel.Hierdie sperm is die wenner van 'n intense seleksieproses waartydens miljoene spermselle deur die vroulike geslagskanaal beweeg, verskeie struikelblokke1 oorkom en kapasitasie ondergaan, wat hul beweeglikheid en die proses van oppervlakkomponente verbeter2,3,4.Selfs al vind die sperm en oösiet mekaar, is die proses nog nie verby nie.Die oösiet word omring deur 'n laag cumulus-selle en 'n glikoproteïenversperring genaamd die zona pellucida, waardeur sperm moet beweeg om die oösiet binne te gaan.Spermatozoa gebruik 'n kombinasie van oppervlakadhesiemolekules en membraangeassosieerde en afgeskeide ensieme om hierdie finale hindernisse te oorkom5.Hierdie molekules en ensieme word hoofsaaklik in die binnemembraan en akrosomale matriks gestoor en word opgespoor wanneer die buitenste membraan van die sperm gelys word tydens die akrosomale reaksie6.Die laaste stap in hierdie intense reis is die sperm-eier samesmelting gebeurtenis, waarin die twee selle hul membrane saamsmelt om 'n enkele diploïede organisme te word7.Alhoewel hierdie proses baanbrekend is in menslike voortplanting, word die nodige molekulêre interaksies swak verstaan.
Benewens die bevrugting van gamete, is die chemie van die samesmelting van twee lipieddubbellae omvattend bestudeer.In die algemeen is membraanfusie 'n energeties ongunstige proses wat vereis dat 'n proteïen katalisator 'n strukturele konformasieverandering ondergaan wat twee membrane nader aan mekaar bring, hul kontinuïteit verbreek en samesmelting veroorsaak8,9.Hierdie proteïen katalisators staan ​​bekend as fusogene en is in ontelbare samesmeltingstelsels gevind.Hulle word benodig vir virale toegang tot gasheerselle (bv. gp160 in MIV-1, styging in koronavirusse, hemagglutinien in griepvirusse)10,11,12 plasentale (sinsitien)13,14,15 en gameetvormende samesmeltings in laer eukariote ( HAP2/GCS1 in plante, protiste en geleedpotiges) 16,17,18,19.Fusogene vir menslike gamete moet nog ontdek word, hoewel verskeie proteïene getoon is om krities te wees vir gameetaanhegting en samesmelting.Die oösiet-uitgedrukte CD9, 'n transmembraanproteïen wat nodig is vir die samesmelting van muis- en menslike gamete, was die eerste wat ontdek is 21,22,23.Alhoewel die presiese funksie daarvan onduidelik bly, lyk 'n rol in adhesie, die struktuur van adhesie-fokuspunte op eiermikrovilli, en/of die korrekte lokalisering van oösietoppervlakproteïene waarskynlik 24,25,26.Die twee mees tipiese proteïene wat krities is vir gameetfusie is die spermproteïen IZUMO127 en die oösietproteïen JUNO28, en hul onderlinge assosiasie is 'n belangrike stap in gameetherkenning en adhesie voor samesmelting.Manlike Izumo1-uitklopmuise en vroulike Juno-uitklopmuise is heeltemal steriel, in hierdie modelle gaan sperm die perivitellienruimte binne, maar gamete versmelt nie.Net so is samevloeiing verminder wanneer gamete behandel is met anti-IZUMO1 of JUNO27,29 teenliggaampies in menslike in vitro bevrugting eksperimente.
Onlangs is 'n nuut ontdekte groep sperm-uitgedrukte proteïene wat fenotipies soortgelyk is aan IZUMO1 en JUNO20,30,31,32,33,34,35 ontdek.Sperm akrosomale membraan-geassosieerde proteïen 6 (SPACA6) is geïdentifiseer as noodsaaklik vir bevrugting in 'n grootskaalse muriene mutagenese studie.Invoeging van die transgeen in die Spaca6-geen produseer nie-smeltbare spermatozoa, alhoewel hierdie spermatozoa die perivitelliene spasie 36 infiltreer.Daaropvolgende uitklopstudies in muise het bevestig dat Spaca6 nodig is vir gameetfusie 30,32.SPACA6 word feitlik uitsluitlik in die testes uitgedruk en het 'n lokaliseringspatroon soortgelyk aan dié van IZUMO1, naamlik binne die intima van die spermatozoa voor die akrosomale reaksie, en migreer dan na die ekwatoriale gebied na die akrosomale reaksie 30,32.Spaca6 homoloë bestaan ​​in 'n verskeidenheid van soogdiere en ander eukariote 30 en die belangrikheid daarvan vir menslike gameet samesmelting is gedemonstreer deur inhibisie van menslike bevrugting in vitro deur weerstand teen SPACA6 30.Anders as IZUMO1 en JUNO, bly die besonderhede van die struktuur, interaksies en funksie van SPACA6 onduidelik.
Om die fundamentele proses onderliggend aan die samesmelting van menslike sperm en eiers beter te verstaan, wat ons in staat sal stel om toekomstige ontwikkelings in gesinsbeplanning en vrugbaarheidsbehandeling in te lig, het ons SPACA6 strukturele en biochemiese studies uitgevoer.Die kristalstruktuur van die ekstrasellulêre domein van SPACA6 toon 'n vier-helikale bundel (4HB) en 'n immunoglobulien-agtige (Ig-agtige) domein verbind deur kwasi-buigsame streke.Soos voorspel in vorige studies, 7,32,37 is die domeinstruktuur van SPACA6 soortgelyk aan dié van menslike IZUMO1, en die twee proteïene deel 'n ongewone motief: 4HB met 'n driehoekige heliese oppervlak en 'n paar disulfiedgekoppelde CXXC-motiewe.Ons stel voor dat IZUMO1 en SPACA6 nou 'n groter, struktureel verwante superfamilie van proteïene definieer wat met gameetfusie geassosieer word.Deur gebruik te maak van kenmerke wat uniek is aan die superfamilie, het ons 'n uitputtende soektog na die AlphaFold-strukturele menslike proteoom uitgevoer, en addisionele lede van hierdie superfamilie geïdentifiseer, insluitend verskeie lede wat betrokke is by gameetfusie en/of bevrugting.Dit blyk nou dat daar 'n algemene strukturele vou en superfamilie van proteïene is wat met gameetfusie geassosieer word, en ons struktuur verskaf 'n molekulêre kaart van hierdie belangrike aspek van die menslike gameetfusiemeganisme.
SPACA6 is 'n enkeldeurlaat-transmembraanproteïen met een N-gekoppelde glikaan en ses vermeende disulfiedbindings (Figure S1a en S2).Ons het die ekstrasellulêre domein van menslike SPACA6 (residu 27-246) in Drosophila S2-selle uitgedruk en die proteïen gesuiwer met behulp van nikkelaffiniteit, katioonuitruiling en grootte-uitsluitingchromatografie (Fig. S1b).Die gesuiwerde SPACA6 ektodomein is baie stabiel en homogeen.Analise met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie gekombineer met veelhoekige ligverstrooiing (SEC-MALS) het een piek met 'n berekende molekulêre gewig van 26.2 ± 0.5 kDa aan die lig gebring (Fig. S1c).Dit stem ooreen met die grootte van die SPACA6 monomeriese ektodomein, wat aandui dat oligomerisering nie tydens suiwering plaasgevind het nie.Daarbenewens het sirkulêre dichroïsme (CD) spektroskopie 'n gemengde α/β struktuur met 'n smeltpunt van 51.3 °C geopenbaar (Fig. S1d,e).Dekonvolusie van die CD-spektra het 38.6% α-helikale en 15.8% β-gestrengelde elemente geopenbaar (Figuur S1d).
Die SPACA6-ektodomein is gekristalliseer deur gebruik te maak van ewekansige matriks-saaiding38 wat gelei het tot 'n datastel met 'n resolusie van 2.2 Å (Tabel 1 en Figuur S3).Met behulp van 'n kombinasie van fragment-gebaseerde molekulêre substitusie en SAD-fasedata met bromiedblootstelling vir struktuurbepaling (Tabel 1 en Figuur S4), bestaan ​​die finale verfynde model uit residue 27-246.Toe die struktuur bepaal is, was daar geen eksperimentele of AlphaFold strukture beskikbaar nie.Die SPACA6 ektodomein meet 20 Å × 20 Å × 85 Å, bestaan ​​uit sewe helikse en nege β-stringe, en het 'n verlengde tersiêre vou gestabiliseer deur ses disulfiedbindings (Fig. 1a, b).Die swak elektrondigtheid aan die einde van die Asn243-syketting dui aan dat hierdie residu 'n N-gekoppelde glikosilering is.Die struktuur bestaan ​​uit twee domeine: 'n N-terminale vier-heliks bundel (4HB) en 'n C-terminale Ig-agtige domein met 'n tussenliggende skarniergebied tussen hulle (Fig. 1c).
a Struktuur van die ekstrasellulêre domein van SPACA6.Strookdiagram van die ekstrasellulêre domein van SPACA6, die kleur van die ketting van N tot C-terminus van donkerblou tot donkerrooi.Sisteïene betrokke by disulfiedbindings word in magenta uitgelig.b Topologie van die ekstrasellulêre domein van SPACA6.Gebruik dieselfde kleurskema as in Figuur 1a.c SPACA6 ekstrasellulêre domein.Die 4HB-, skarnier- en Ig-agtige domeinstrookkaarte is onderskeidelik oranje, groen en blou gekleur.Die lae is nie volgens skaal geteken nie.
Die 4HB-domein van SPACA6 sluit vier hoofhelikse (helikse 1-4) in, wat in die vorm van 'n helikse heliks (Fig. 2a) gerangskik is, afwisselend tussen antiparallelle en parallelle interaksies (Fig. 2b).'n Klein addisionele enkeldraai-heliks (heliks 1′) word loodreg op die bundel gelê, wat 'n driehoek vorm met heliks 1 en 2. Hierdie driehoek is effens vervorm in die heliks-gedraaide pakking van die relatief digte pakking van helikse 3 en 4 ( Fig. 2a).
4HB N-terminale strookkaart.b Boaansig van 'n bondel van vier helikse, elke heliks uitgelig in donkerblou by die N-terminus en donkerrooi by die C-terminus.c Top-down spiraalwieldiagram vir 4HB, met elke oorblyfsel getoon as 'n sirkel gemerk met 'n enkelletter-aminosuurkode;slegs die vier aminosure aan die bokant van die wiel is genommer.Nie-polêre residue is geel gekleur, polêre ongelaaide residue is groen gekleur, positief gelaaide residue is blou gekleur en negatief gelaaide residue is rooi gekleur.d Driehoekige vlakke van die 4HB-domein, met 4HBs in oranje en skarniere in groen.Albei insetsels toon staafvormige disulfiedbindings.
4HB is gekonsentreer op 'n binneste hidrofobiese kern wat hoofsaaklik uit alifatiese en aromatiese residue bestaan ​​(Fig. 2c).Die kern bevat 'n disulfiedbinding tussen Cys41 en Cys55 wat helikse 1 en 2 met mekaar verbind in 'n boonste verhewe driehoek (Fig. 2d).Twee bykomende disulfiedbindings is gevorm tussen die CXXC-motief in Helix 1' en 'n ander CXXC-motief wat by die punt van die β-haarnaald in die skarniergebied gevind is (Fig. 2d).'n Konserwatiewe arginienresidu met 'n onbekende funksie (Arg37) is geleë binne 'n hol driehoek wat gevorm word deur helikse 1', 1 en 2. Alifatiese koolstofatome Cβ, Cγ en Cδ Arg37 wissel met die hidrofobiese kern, en sy guanidiengroepe beweeg siklies tussen helikse 1' en 1 via interaksies tussen die Thr32-ruggraat en syketting (Fig. S5a,b).Tyr34 strek tot in die holte en verlaat twee klein holtes waardeur Arg37 met die oplosmiddel in wisselwerking kan tree.
Ig-agtige β-toebroodjie-domeine is 'n groot superfamilie van proteïene wat die gemeenskaplike kenmerk deel van twee of meer meerstrengige amfipatiese β-velle wat interaksie het via 'n hidrofobiese kern 39. Die C-terminale Ig-agtige domein van SPACA6 het dieselfde patroon en bestaan ​​uit twee lae (Fig. S6a).Vel 1 is 'n β-vel van vier stringe (stringe D, F, H en I) waar stringe F, H en I 'n anti-parallelle rangskikking vorm, en stringe I en D 'n parallelle interaksie aanneem.Tabel 2 is 'n klein anti-parallelle dubbelstring beta-vel (stringe E en G).'n Interne disulfiedbinding is waargeneem tussen die C-terminus van die E-ketting en die middel van die H-ketting (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Hierdie disulfiedbinding is analoog aan die disulfiedbinding in die β-toebroodjie-domein van immunoglobulien40,41.
Die vier-string β-vel draai oor sy hele lengte en vorm asimmetriese rande wat verskil in vorm en elektrostatika.Die dunner rand is 'n plat hidrofobiese omgewingsoppervlak wat uitstaan ​​in vergelyking met die oorblywende ongelyke en elektrostaties diverse oppervlaktes in SPACA6 (Fig. S6b,c).'n Halo van blootgestelde ruggraatkarboniel/aminogroepe en polêre sykettings omring die hidrofobiese oppervlak (Fig. S6c).Die wyer marge word gedek deur 'n bedekte heliese segment wat die N-terminale gedeelte van die hidrofobiese kern blokkeer en vorm drie waterstofbindings met die oop polêre groep van die F-ketting ruggraat (Fig. S6d).Die C-terminale gedeelte van hierdie rand vorm 'n groot sak met 'n gedeeltelik blootgestelde hidrofobiese kern.Die sak word omring deur positiewe ladings as gevolg van drie stelle dubbele arginienreste (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 en Arg212-Arg214) en 'n sentrale histidien (His220) (Figuur S6e).
Die skarniergebied is 'n kort segment tussen die heliese domein en die Ig-agtige domein, wat bestaan ​​uit een antiparallelle driestrengige β-laag (stringe A, B en C), 'n klein 310-heliks en verskeie lang ewekansige heliese segmente.(Fig. S7).'n Netwerk van kovalente en elektrostatiese kontakte in die skarniergebied blyk die oriëntasie tussen 4HB en die Ig-agtige domein te stabiliseer.Die netwerk kan in drie dele verdeel word.Die eerste deel bevat twee CXXC-motiewe (27CXXC30 en 139CXXC142) wat 'n paar disulfiedbindings tussen die β-haarnaald in die skarnier en die 1'-heliks in 4HB vorm.Die tweede deel sluit elektrostatiese interaksies tussen die Ig-agtige domein en die skarnier in.Glu132 in die skarnier vorm 'n soutbrug met Arg233 in die Ig-agtige domein en Arg135 in die skarnier.Die derde deel sluit 'n kovalente binding tussen die Ig-agtige domein en die skarniergebied in.Twee disulfiedbindings (Cys124-Cys147 en Cys128-Cys153) verbind die skarnierlus aan 'n skakelaar wat gestabiliseer word deur elektrostatiese interaksies tussen Gln131 en die ruggraat funksionele groep, wat toegang tot die eerste Ig-agtige domein toelaat.ketting.
Die struktuur van die SPACA6 ektodomein en individuele strukture van 4HB en Ig-agtige domeine is gebruik om struktureel soortgelyke rekords in proteïendatabasisse 42 te soek.Ons het passings geïdentifiseer met hoë Dali Z-tellings, klein standaardafwykings en groot LALI-tellings (laasgenoemde is die aantal struktureel ekwivalente residue).Terwyl die eerste 10 treffers van die volledige ektodomeinsoektog (Tabel S1) 'n aanvaarbare Z-telling van >842 gehad het, het 'n soektog na 4HB of Ig-agtige domein alleen getoon dat die meeste van hierdie treffers slegs met β-toebroodjies ooreenstem.'n alomteenwoordige vou wat in baie proteïene voorkom.Al drie soektogte in Dali het slegs een resultaat opgelewer: IZUMO1.
Daar word lankal voorgestel dat SPACA6 en IZUMO1 strukturele ooreenkomste7,32,37 deel.Alhoewel die ektodomeine van hierdie twee gameetfusie-geassosieerde proteïene slegs 21% volgorde-identiteit deel (Figuur S8a), het komplekse bewyse, insluitend 'n gekonserveerde disulfiedbindingspatroon en 'n voorspelde C-terminale Ig-agtige domein in SPACA6, vroeë pogings moontlik gemaak om 'n homologie model van A 'n SPACA6 muis met behulp van IZUMO1 as 'n sjabloon37.Ons struktuur bevestig hierdie voorspellings en toon die ware mate van ooreenkoms.Trouens, die SPACA6 en IZUMO137,43,44 strukture deel dieselfde twee-domein argitektuur (Fig. S8b) met soortgelyke 4HB en Ig-agtige β-toebroodjie domeine verbind deur 'n skarnier streek (Fig. S8c).
IZUMO1 en SPACA6 4HB het algemene verskille van konvensionele spiraalbundels.Tipiese 4HB's, soos dié wat gevind word in SNARE-proteïenkomplekse betrokke by endosomale samesmelting 45,46, het eweredig gespasieerde helikse wat 'n konstante kromming om 'n sentrale as 47 handhaaf. Daarteenoor was die heliese domeine in beide IZUMO1 en SPACA6 verwronge, met veranderlike kromming en ongelyke pakking (Figuur S8d).Die draai, waarskynlik veroorsaak deur die driehoek wat deur helikse 1', 1 en 2 gevorm word, word in IZUMO1 en SPACA6 behou en gestabiliseer deur dieselfde CXXC-motief op heliks 1'.Die bykomende disulfiedbinding wat in SPACA6 gevind word (Cys41 en Cys55 wat helikse 1 en 2 kovalent koppel hierbo) skep egter 'n skerper toppunt by die driehoek se toppunt, wat SPACA6 meer gedraai maak as IZUMO1, met meer uitgesproke holte driehoeke.Daarbenewens het IZUMO1 nie Arg37 wat in die middel van hierdie holte in SPACA6 waargeneem is nie.Daarteenoor het IZUMO1 'n meer tipiese hidrofobiese kern van alifatiese en aromatiese residue.
IZUMO1 het 'n Ig-agtige domein wat bestaan ​​uit 'n dubbel- en vyfstring β-vel43.Die ekstra string in IZUMO1 vervang die spoel in SPACA6, wat met die F-string in wisselwerking tree om ruggraatwaterstofbindings in die string te beperk.'n Interessante punt van vergelyking is die voorspelde oppervlaklading van die Ig-agtige domeine van die twee proteïene.Die IZUMO1-oppervlak is meer negatief gelaai as die SPACA6-oppervlak.'n Bykomende lading is naby die C-terminus wat na die spermmembraan kyk, geleë.In SPACA6 was dieselfde streke meer neutraal of positief gelaai (Fig. S8e).Byvoorbeeld, die hidrofobiese oppervlak (dunner kante) en positief gelaaide putte (wyer rande) in SPACA6 is negatief gelaai in IZUMO1.
Alhoewel die verwantskap en sekondêre struktuurelemente tussen IZUMO1 en SPACA6 goed bewaar word, het die strukturele belyning van die Ig-agtige domeine getoon dat die twee domeine verskil in hul algemene oriëntasie relatief tot mekaar (Fig. S9).Die spiraalbundel van IZUMO1 is geboë om die β-toebroodjie, wat die voorheen beskryfde "boemerang"-vorm op ongeveer 50° vanaf die sentrale as skep.Daarteenoor was die heliese balk in SPACA6 ongeveer 10° in die teenoorgestelde rigting gekantel.Die verskille in hierdie oriëntasies is waarskynlik te wyte aan verskille in die skarniergebied.Op die primêre volgordevlak deel IZUMO1 en SPACA6 min volgordeooreenkomste by die skarnier, met die uitsondering van sisteïen-, glisien- en asparaginsuurreste.As gevolg hiervan is waterstofbindings en elektrostatiese netwerke heeltemal anders.β-blad sekondêre struktuurelemente word deur IZUMO1 en SPACA6 gedeel, alhoewel die kettings in IZUMO1 baie langer is en die 310-heliks (heliks 5) uniek aan SPACA6 is.Hierdie verskille lei tot verskillende domeinoriëntasies vir twee andersins soortgelyke proteïene.
Ons Dali-bedienersoektog het aan die lig gebring dat SPACA6 en IZUMO1 die enigste twee eksperimenteel bepaalde strukture is wat in die proteïendatabasis gestoor is wat hierdie spesifieke 4HB-vou het (Tabel S1).Meer onlangs het DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold ontwikkel, 'n neurale netwerkgebaseerde stelsel wat die 3D-strukture van proteïene vanaf primêre rye akkuraat kan voorspel48.Kort nadat ons die SPACA6-struktuur opgelos het, is die AlphaFold-databasis vrygestel, wat voorspellende struktuurmodelle verskaf wat 98.5% van alle proteïene in die menslike proteoom dek48,49.Deur ons opgelosde SPACA6-struktuur as 'n soekmodel te gebruik, het 'n strukturele homologiesoektog na die model in die AlphaFold menslike proteoom kandidate geïdentifiseer met moontlike strukturele ooreenkomste met SPACA6 en IZUMO1.Gegewe die ongelooflike akkuraatheid van AlphaFold in die voorspelling van SPACA6 (Fig. S10a)—veral die 1.1 Å rms ektodomein in vergelyking met ons opgeloste struktuur (Fig. S10b)—kan ons vol vertroue wees dat die geïdentifiseerde SPACA6-passings waarskynlik akkuraat sal wees.
Voorheen het PSI-BLAST gesoek na die IZUMO1-kluster met drie ander sperm-geassosieerde proteïene: IZUMO2, IZUMO3 en IZUMO450.AlphaFold het voorspel dat hierdie IZUMO-familieproteïene in die 4HB-domein vou met dieselfde disulfiedbindingspatroon as IZUMO1 (Figure 3a en S11), alhoewel hulle nie 'n Ig-agtige domein het nie.Daar word veronderstel dat IZUMO2 en IZUMO3 eensydige membraanproteïene soortgelyk aan IZUMO1 is, terwyl IZUMO4 blykbaar afgeskei word.Die funksies van IZUMO 2, 3 en 4 proteïene in gameetfusie is nie bepaal nie.Dit is bekend dat IZUMO3 'n rol speel in akrosoombiogenese tydens spermatosoë-ontwikkeling51, en die IZUMO-proteïen vorm 'n kompleks50.Die bewaring van IZUMO-proteïene in soogdiere, reptiele en amfibieë dui daarop dat hul potensiële funksie ooreenstem met dié van ander bekende gameet-fusie-geassosieerde proteïene, soos DCST1/2, SOF1 en FIMP.
Diagram van die domeinargitektuur van die IST-superfamilie, met 4HB-, skarnier- en Ig-agtige domeine wat onderskeidelik in oranje, groen en blou uitgelig is.IZUMO4 het 'n unieke C-terminale streek wat swart lyk.Bevestigde en vermeende disulfiedbindings word onderskeidelik deur soliede en stippellyne getoon.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F95), (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F95), DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) word in dieselfde kleurreeks as paneel A vertoon. Disulfiedbindings word in magenta getoon.TMEM95, IZUMO2 en IZUMO3 transmembraanhelikse word nie getoon nie.
Anders as die IZUMO-proteïen, word ander SPACA-proteïene (dws SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 en SPACA9) vermoedelik struktureel verskillend van SPACA6 (Fig. S12).Slegs SPACA9 het 4HB, maar dit word nie verwag om dieselfde parallel-anti-parallelle oriëntasie of dieselfde disulfiedbinding as SPACA6 te hê nie.Slegs SPACA1 het 'n soortgelyke Ig-agtige domein.AlphaFold voorspel dat SPACA3, SPACA4 en SPACA5 'n heeltemal ander struktuur as SPACA6 het.Interessant genoeg is dit bekend dat SPACA4 ook 'n rol speel in bevrugting, maar in 'n groter mate as SPACA6, en eerder die interaksie tussen sperm en oösiet zona pellucida52 vergemaklik.
Ons AlphaFold-soektog het nog 'n passing gevind vir IZUMO1 en SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, 'n enkele sperm-spesifieke transmembraanproteïen, maak manlike muise onvrugbaar wanneer geablateer 32,33.Spermatozoa wat TMEM95 ontbreek het normale morfologie, beweeglikheid en die vermoë om die zona pellucida binne te dring en aan die eiermembraan te bind, maar kon nie met die oösietmembraan saamsmelt nie.Vorige studies het getoon dat TMEM95 strukturele ooreenkomste met IZUMO133 deel.Inderdaad, die AlphaFold-model het bevestig dat TMEM95 'n 4HB is met dieselfde paar CXXC-motiewe as IZUMO1 en SPACA6 en dieselfde bykomende disulfiedbinding tussen helikse 1 en 2 gevind in SPACA6 (Fig. 3a en S11).Alhoewel TMEM95 nie 'n Ig-agtige domein het nie, het dit 'n streek met 'n disulfiedbindingspatroon soortgelyk aan die SPACA6- en IZUMO1-skarnierstreke (Fig. 3b).Ten tyde van publikasie van hierdie manuskrip het die voordrukbediener die struktuur van TMEM95 gerapporteer, wat die AlphaFold53-resultaat bevestig.TMEM95 is baie soortgelyk aan SPACA6 en IZUMO1 en word evolusionêr reeds in amfibieë bewaar (Fig. 4 en S13).
Die PSI-BLAST-soektog het die NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP en SOF1 databasisse gebruik om die posisie van hierdie rye in die boom van die lewe te bepaal.Afstande tussen takpunte word nie volgens skaal getoon nie.
Die treffende algehele strukturele ooreenkoms tussen SPACA6 en IZUMO1 dui daarop dat hulle stigterslede is van 'n bewaarde strukturele superfamilie wat die TMEM95 en IZUMO 2, 3 en 4 proteïene insluit.bekende lede: IZUMO1, SPACA6 en TMEM95.Omdat slegs 'n paar lede Ig-agtige domeine besit, is die kenmerk van die IST-superfamilie die 4HB-domein, wat unieke kenmerke het wat gemeen is aan al hierdie proteïene: 1) Opgerolde 4HB met helikse gerangskik in 'n anti-parallelle/parallelle afwisseling (Fig. 5a), 2) die bundel het 'n driehoekige gesig wat bestaan ​​uit twee helikse binne die bundel en 'n derde vertikale heliks (Fig. sleutelarea (Fig. 5c). Dit is bekend dat die CXXC-motief, wat in tioredoksienagtige proteïene voorkom, funksioneer. as 'n redokssensor 54,55,56, terwyl die motief in IST-familielede geassosieer kan word met proteïendisulfied-isomerases soos ERp57 in gameetfusie.Rolle word geassosieer 57,58.
Lede van die IST-superfamilie word gedefinieer deur drie kenmerkende kenmerke van die 4HB-domein: vier helikse wat wissel tussen parallelle en antiparallelle oriëntasie, ba-driehoekige heliese bondelvlakke, en 'n ca CXXC dubbelmotief wat tussen klein molekules gevorm word.) N-terminale helikse (oranje) en skarniergebied β-haarnaald (groen).
Gegewe die ooreenkoms tussen SPACA6 en IZUMO1, is die vermoë van eersgenoemde om aan IZUMO1 of JUNO te bind, getoets.Biolaag interferometrie (BLI) is 'n kineties-gebaseerde bindingsmetode wat voorheen gebruik is om die interaksie tussen IZUMO1 en JUNO te kwantifiseer.Na inkubasie van die biotien-gemerkte sensor met IZUMO1 as 'n lokaas met 'n hoë konsentrasie JUNO analiet, is 'n sterk sein opgespoor (Fig. S14a), wat 'n binding-geïnduseerde verandering in die dikte van die biomateriaal wat aan die sensorpunt geheg is, aandui.Soortgelyke seine (dws JUNO gekoppel aan die sensor as 'n lokaas teen IZUMO1 analiet) (Fig. S14b).Geen sein is opgespoor wanneer SPACA6 as 'n analiet teen sensorgebonde IZUMO1 of sensorgebonde JUNO gebruik is nie (Figuur S14a,b).Die afwesigheid van hierdie sein dui aan dat die ekstrasellulêre domein van SPACA6 nie interaksie het met die ekstrasellulêre domein van IZUMO1 of JUNO nie.
Omdat die BLI-toets gebaseer is op biotinylering van vrye lisienreste op die lokaasproteïen, kan hierdie modifikasie binding voorkom as lisienreste by die interaksie betrokke is.Daarbenewens kan die oriëntasie van die binding relatief tot die sensor steriese hindernisse skep, so konvensionele aftrektoetse is ook op die rekombinante SPACA6, IZUMO1 en JUNO ektodomeine uitgevoer.Ten spyte hiervan het SPACA6 nie neerslag gevind met His-gemerkte IZUMO1 of His-gemerkte JUNO (Fig. S14c, d), wat geen interaksie aandui wat ooreenstem met dié wat in BLI-eksperimente waargeneem is nie.As 'n positiewe kontrole het ons die interaksie van JUNO met gemerkte His IZUMO1 (Figure S14e en S15) bevestig.
Ten spyte van die strukturele ooreenkoms tussen SPACA6 en IZUMO1, is die onvermoë van SPACA6 om JUNO te bind nie verbasend nie.Die oppervlak van menslike IZUMO1 het meer as 20 residue wat in wisselwerking met JUNO, insluitend residue van elk van die drie streke (alhoewel die meeste van hulle is geleë in die skarnier streek) (Fig. S14f).Van hierdie reste word slegs een in SPACA6 (Glu70) bewaar.Terwyl baie restsubstitusies hul oorspronklike biochemiese eienskappe behou het, is die noodsaaklike Arg160-residu in IZUMO1 vervang deur die negatief gelaaide Asp148 in SPACA6;vorige studies het getoon dat die Arg160Glu-mutasie in IZUMO1 binding aan JUNO43 byna heeltemal ophef.Daarbenewens het die verskil in domeinoriëntasie tussen IZUMO1 en SPACA6 die oppervlakte van die JUNO-bindingsplek van die ekwivalente streek op SPACA6 aansienlik verhoog (Fig. S14g).
Ten spyte van die bekende behoefte aan SPACA6 vir gameetfusie en sy ooreenkoms met IZUMO1, blyk dit nie dat SPACA6 'n ekwivalente JUNO-bindingsfunksie het nie.Daarom het ons probeer om ons strukturele data te kombineer met bewyse van belangrikheid wat deur evolusionêre biologie verskaf word.Volgorde-belyning van SPACA6 homoloë toon die behoud van die gemeenskaplike struktuur buite soogdiere.Sisteïenreste is byvoorbeeld teenwoordig selfs in ver-verwante amfibieë (Fig. 6a).Deur die ConSurf-bediener te gebruik, is meervoudige volgordebelyningsbehouddata van 66 rye na die SPACA6-oppervlak gekarteer.Hierdie tipe analise kan aantoon watter residue tydens proteïen-evolusie behoue ​​gebly het en kan aandui watter oppervlakstreke 'n rol in funksie speel.
'n Volgorde-belyning van SPACA6 ektodomeine van 12 verskillende spesies wat met CLUSTAL OMEGA voorberei is.Volgens die ConSurf-ontleding is die mees konserwatiewe posisies in blou gemerk.Sisteïenreste word in rooi uitgelig.Domeingrense en sekondêre struktuurelemente word aan die bokant van die belyning getoon, waar pyle β-stringe aandui en golwe helikse aandui.Die NCBI Access Identifiers wat die rye bevat, is: mens (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin aap (Cebus nabootser, XP_017359366), perd (Equus caballus, XP6_0235 killer, XP60235 killer, XP6102ca, XP61023, XP61023, XP61023, XP61023, XP6023, XP602323, XP6102323, XP60235 of 032_034) .), skaap (Ovis aries, XP_014955560), olifant (Loxodonta africana, XP_010585293), hond (Canis lupus familyis, XP_025277208), muis (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil, XPi3_1, XPi6_1, XPi31, XPi31, XPi31, XPi31 ), Platypus, 8) , 61_89 en Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Die nommering is gebaseer op menslike orde.b Oppervlakvoorstelling van die SPACA6-struktuur met 4HB aan die bokant en Ig-agtige domein aan die onderkant, kleure gebaseer op bewaringskattings vanaf die ConSurf-bediener.Die bes bewaarde dele is in blou, die matig bewaarde dele is in wit en die mins bewaarde dele is in geel.pers sisteïen.Drie oppervlak kolle wat 'n hoë vlak van beskerming demonstreer word in die insetsel gemerkte kolle 1, 2 en 3 getoon. 'n 4HB spotprent word in die insetsel regs bo gewys (dieselfde kleurskema).
Die SPACA6-struktuur het drie hoogs bewaarde oppervlakstreke (Fig. 6b).Pleister 1 strek oor 4HB en die skarniergebied en bevat twee bewaarde CXXC disulfiedbrûe, 'n Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 skarniernetwerk (Fig. S7), en drie bewaarde buitenste aromatiese residue (Phe31, Tyr73, Phe137)).'n breër rand van die Ig-agtige domein (Fig. S6e), wat verskeie positief gelaaide residue op die spermoppervlak verteenwoordig.Interessant genoeg, hierdie pleister bevat 'n teenliggaam epitoop wat voorheen getoon is om in te meng met SPACA6 30 funksie.Streek 3 strek oor die skarnier en een kant van die Ig-agtige domein;hierdie streek bevat gekonserveerde proliene (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) en uitwaartse polêre/gelaaide residue.Verbasend genoeg is die meeste van die residue op die oppervlak van 4HB hoogs veranderlik (Fig. 6b), alhoewel die vou regdeur die SPACA6 homoloog bewaar word (soos aangedui deur die konserwatisme van die hidrofobiese bundelkern) en verder as die IST superfamilie.
Alhoewel dit die kleinste gebied in SPACA6 is met die minste waarneembare sekondêre struktuurelemente, is baie skarniergebied-oorblyfsels (insluitend streek 3) hoogs behoue ​​onder SPACA6-homoloë, wat kan aandui dat die oriëntasie van die heliese bundel en β-toebroodjie 'n rol speel.as konserwatief.Ten spyte van uitgebreide waterstofbinding en elektrostatiese netwerke in die skarniergebied van SPACA6 en IZUMO1, kan bewyse van intrinsieke buigsaamheid egter gesien word in die belyning van die veelvuldige toegelate strukture van IZUMO137,43,44.Die belyning van die individuele domeine het goed oorvleuel, maar die oriëntasie van die domeine relatief tot mekaar het gewissel van 50° tot 70° vanaf die sentrale as (Fig. S16).Om die konformasiedinamika van SPACA6 in oplossing te verstaan, is SAXS eksperimente uitgevoer (Fig. S17a,b).Ab initio rekonstruksie van die SPACA6-ektodomein het aan 'n staafkristalstruktuur voldoen (Fig. S18), alhoewel die Kratky-plot 'n mate van buigsaamheid getoon het (Fig. S17b).Hierdie konformasie staan ​​in kontras met IZUMO1, waarin die ongebonde proteïen 'n boemerangvorm aanneem beide in die rooster en in oplossing43.
Om spesifiek die buigsame streek te identifiseer, is waterstof-deuterium-uitruilmassaspektroskopie (H-DXMS) op SPACA6 uitgevoer en vergelyk met data wat voorheen verkry is op IZUMO143 (Fig. 7a,b).SPACA6 is duidelik meer buigsaam as IZUMO1, soos aangedui deur 'n hoër deuterium-uitruiling regdeur die struktuur na 100 000 s se uitruiling.In beide strukture toon die C-terminale deel van die skarniergebied 'n hoë vlak van uitruiling, wat waarskynlik beperkte rotasie van 4HB en Ig-agtige domeine relatief tot mekaar toelaat.Interessant genoeg is die C-terminale deel van die SPACA6-skarnier, bestaande uit die 147CDLPLDCP154-residu, 'n hoogs gekonserveerde streek 3 (Fig. 6b), wat moontlik aandui dat interdomein-buigsaamheid 'n evolusionêr bewaarde kenmerk van SPACA6 is.Volgens die buigsaamheidsanalise het CD termiese smeltdata getoon dat SPACA6 (Tm = 51.2°C) minder stabiel is as IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Fig. S1e en S19).
a H-DXMS beelde van SPACA6 en b IZUMO1.Die persentasie deuterium-uitruiling is op die aangeduide tydpunte bepaal.Vlakke van waterstof-deuterium-uitruiling word deur kleur op 'n gradiëntskaal van blou (10%) tot rooi (90%) aangedui.Swart bokse verteenwoordig gebiede van hoë ruil.Die grense van 4HB, skarnier en Ig-agtige domein wat in die kristalstruktuur waargeneem word, word bo die primêre volgorde getoon.Deuterium-uitruilvlakke by 10 s, 1000 s en 100 000 s is op 'n strookkaart gesuperponeer op die deursigtige molekulêre oppervlaktes van SPACA6 en IZUMO1.Dele van strukture met 'n deuterium-uitruilvlak onder 50% is wit gekleur.Gebiede bo 50% H-DXMS-uitruiling word in 'n gradiëntskaal gekleur.
Die gebruik van CRISPR/Cas9 en muis geen uitklop genetiese strategieë het gelei tot die identifisering van verskeie faktore wat belangrik is vir sperm- en eierselbinding en samesmelting.Afgesien van die goed-gekarakteriseerde interaksie van IZUMO1-JUNO en CD9 struktuur, bly die meeste van die proteïene wat met gameetfusie geassosieer word, struktureel en funksioneel enigmaties.Die biofisiese en strukturele karakterisering van SPACA6 is nog 'n stukkie van die adhesie/fusie molekulêre legkaart tydens bevrugting.
SPACA6 en ander lede van die IST superfamilie blyk hoogs bewaar te wees in soogdiere sowel as individuele voëls, reptiele en amfibieë;Trouens, daar word gedink dat SPACA6 selfs nodig is vir bevrugting in sebravis 59. Hierdie verspreiding is soortgelyk aan ander bekende gameetfusie-geassosieerde proteïene soos DCST134, DCST234, FIMP31 en SOF132, wat daarop dui dat hierdie faktore HAP2-tekort is (ook bekend as GCS1) proteïene wat verantwoordelik is vir die katalitiese aktiwiteit van baie protiste., plante en geleedpotiges.Bevrugte samesmeltingsproteïene 60, 61. Ten spyte van die sterk strukturele ooreenkoms tussen SPACA6 en IZUMO1, het uitskakeling van gene wat vir een van hierdie proteïene kodeer tot onvrugbaarheid in manlike muise gelei, wat aandui dat hul funksies in gameetfusie nie gedupliseer word nie..Meer in die breë, geen van die bekende spermproteïene wat benodig word vir die adhesiefase van samesmelting is oorbodig nie.
Dit bly 'n ope vraag of SPACA6 (en ander lede van die IST-superfamilie) aan intergametiese aansluitings deelneem, intragametiese netwerke vorm om belangrike proteïene na samesmeltingspunte te werf, of dalk selfs as ontwykende fusogene optree.Ko-immunopresipitasie studies in HEK293T selle het 'n interaksie tussen vollengte IZUMO1 en SPACA632 geopenbaar.Ons rekombinante ektodomeine het egter nie in vitro interaksie gehad nie, wat daarop dui dat die interaksies gesien in Noda et al.is albei in die konstruk gedeleteer (let op die sitoplasmiese stert van IZUMO1, wat getoon is dat dit onnodig is vir bevrugting62).Alternatiewelik kan IZUMO1 en/of SPACA6 spesifieke bindingsomgewings vereis wat ons nie in vitro reproduseer nie, soos fisiologies spesifieke konformasies of molekulêre komplekse wat ander proteïene bevat (bekend of nog nie ontdek nie).Alhoewel daar geglo word dat die IZUMO1 ektodomein aanhegting van spermatozoa aan die eiersel in die perivitelliene spasie bemiddel, is die doel van die SPACA6 ektodomein onduidelik.
Die struktuur van SPACA6 openbaar verskeie bewaarde oppervlaktes wat betrokke kan wees by proteïen-proteïen interaksies.Die bewaarde deel van die skarniergebied onmiddellik aangrensend aan die CXXC-motief (aangewys Pleister 1 hierbo) het verskeie uitwaarts-gerigte aromatiese residue wat dikwels geassosieer word met hidrofobiese en π-stapeling-interaksies tussen biomolekules.Die breë kante van die Ig-agtige domein (streek 2) vorm 'n positief gelaaide groef met hoogs bewaarde Arg en His residue, en teenliggaampies teen hierdie streek is voorheen gebruik om gameetfusie 30 te blokkeer.Die teenliggaam herken die lineêre epitoop 212RIRPAQLTHRGTFS225, wat drie van die ses arginienresidu het en hoogs gekonserveerde His220.Dit is nie duidelik of die disfunksie te wyte is aan blokkasie van hierdie spesifieke residue of die hele streek nie.Die ligging van hierdie gaping naby die C-terminus van die β-toebroodjie dui op cis-interaksies met naburige spermproteïene, maar nie met oösietproteïene nie.Verder kan die behoud van 'n hoogs buigsame prolienryke warboel (plek 3) binne die skarnier die plek wees van 'n proteïen-proteïen interaksie of, meer waarskynlik, die behoud van buigsaamheid tussen die twee domeine aandui.Geslag is belangrik vir die onbekende rol van SPACA6.samesmelting van gamete.
SPACA6 het eienskappe van intersellulêre adhesieproteïene, insluitend Ig-agtige β-toebroodjies.Baie kleefproteïene (bv. cadheriene, integrine, adhesiene en IZUMO1) besit een of meer β-toebroodjie-domeine wat proteïene van die selmembraan na hul omgewingsteikens uitbrei63,64,65.Die Ig-agtige domein van SPACA6 bevat ook 'n motief wat algemeen voorkom in β-toebroodjies van adhesie en kohesie: dubbeltjies van parallelle stringe aan die ente van β-toebroodjies, bekend as meganiese klampe66.Daar word geglo dat hierdie motief weerstand teen skuifkragte verhoog, wat waardevol is vir proteïene wat betrokke is by intersellulêre interaksies.Ten spyte van hierdie ooreenkoms met adhesiene, is daar tans geen bewyse dat SPACA6 interaksie met eierwitte het nie.Die SPACA6-ektodomein is nie in staat om aan JUNO te bind nie, en SPACA6-uitdrukkende HEK293T-selle, soos hier getoon, het skaars interaksie met oösiete wat sona 32 ontbreek.As SPACA6 wel intergametiese bindings tot stand bring, kan hierdie interaksies post-translasionele modifikasies of stabilisering deur ander spermproteïene vereis.Ter ondersteuning van laasgenoemde hipotese bind IZUMO1-tekorte spermatosoa aan oösiete, wat demonstreer dat ander molekules as IZUMO1 betrokke is by die gameet adhesie stap 27.
Baie virale, sellulêre en ontwikkelingsamesmeltingsproteïene het eienskappe wat hul funksie as fusogene voorspel.Virale samesmeltingsglikoproteïene (klasse I, II en III) het byvoorbeeld 'n hidrofobiese samesmeltingpeptied of lus aan die einde van die proteïen wat in die gasheermembraan ingevoeg word.Die hidrofilisiteitskaart van IZUMO143 en die struktuur (bepaal en voorspel) van die IST-superfamilie het geen oënskynlike hidrofobiese samesmeltingpeptied getoon nie.Dus, as enige proteïene in die IST-superfamilie as fusogene funksioneer, doen hulle dit op 'n manier anders as ander bekende voorbeelde.
Ten slotte, die funksies van die lede van die IST-superfamilie van proteïene wat met gameetfusie geassosieer word, bly 'n prikkelende raaisel.Ons gekenmerk SPACA6 rekombinante molekule en sy opgeloste struktuur sal insig gee in die verhoudings tussen hierdie gedeelde strukture en hul rol in gameet aanhegting en samesmelting.
Die DNA-volgorde wat ooreenstem met die voorspelde menslike SPACA6-ektodomein (NCBI-toegangsnommer NP_001303901.1; residue 27–246) is kodon-geoptimaliseer vir uitdrukking in Drosophila melanogaster S2-selle en gesintetiseer as 'n geenfragment met die volgorde wat Kozak (Eurofins Genomics) kodeer., die BiP-afskeidingsein en die ooreenstemmende 5'- en 3'-punte vir ligasie-onafhanklike kloning van hierdie geen in 'n pMT-uitdrukkingsvektor gebaseer op 'n metallotioneïenpromotor wat vir seleksie met puromisien (pMT-puro) gemodifiseer is.Die pMT-puro vektor kodeer 'n trombien splitsing plek gevolg deur 'n 10x-His C-terminale merker (Figuur S2).
Stabiele transfeksie van die SPACA6 pMT-puro vektor in D. melanogaster S2 (Gibco) selle is uitgevoer soortgelyk aan die protokol wat vir IZUMO1 en JUNO43 gebruik is.S2-selle is ontdooi en gegroei in Schneider se medium (Gibco) aangevul met 'n finale konsentrasie van 10% (v/v) hitte-geïnaktiveerde fetale kalfserum (Gibco) en 1X antimikotiese antibiotika (Gibco).Vroeë deurgang selle (3.0 x 106 selle) is uitgeplaat in individuele putte van 6-put plate (Corning).Na 24 uur se inkubasie by 27°C, is selle getransfekteer met 'n mengsel van 2 mg van die SPACA6 pMT-puro vektor en Effectene transfeksie reagens (Qiagen) volgens die vervaardiger se protokol.Getransfekteerde selle is vir 72 uur geïnkubeer en dan met 6 mg/ml puromisien geoes.Selle is dan geïsoleer uit volledige Schneider se medium en geplaas in serumvrye Insek-XPRESS medium (Lonza) vir grootskaalse proteïenproduksie.'n 1 L bondel S2-selkultuur is tot 8-10 × 106 ml-1 selle gekweek in 'n 2 L geventileerde platbodem polipropileen Erlenmeyer-fles en dan gesteriliseer met 'n finale konsentrasie van 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) en steriel gefiltreer.geïnduseer.Die geïnduseerde kulture is vir vier dae by 27°C teen 120 rpm geïnkubeer.
Gekondisioneerde medium wat SPACA6 bevat is geïsoleer deur sentrifugering by 5660×g by 4°C gevolg deur 'n Centramate tangensiële vloei filtrasiestelsel (Pall Corp) met 'n 10 kDa MWCO membraan.Dien gekonsentreerde medium wat SPACA6 bevat toe op 'n 2 ml Ni-NTA agarose hars (Qiagen) kolom.Die Ni-NTA-hars is gewas met 10 kolomvolumes (CV) van buffer A en dan is 1 CV van buffer A bygevoeg om 'n finale imidasoolkonsentrasie van 50 mM te gee.SPACA6 is geëlueer met 10 ml buffer A aangevul met imidasool tot 'n finale konsentrasie van 500 mM.Beperkingsklas trombien (Millipore Sigma) is direk by die dialisebuis (MWCO 12-14 kDa) gevoeg teen 1 eenheid per mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 en 150 mM NaCl (buffer B) vir dialise.) by 4°C vir 48 uur.Die trombien-gesplitste SPACA6 is toe drievoudig verdun om soutkonsentrasie te verminder en op 'n 1 ml MonoS 5/50 GL katioonuitruilkolom (Cytiva/GE) gelaai wat met 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, geëquilibreer is.Die katioonuitruiler is gewas met 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, daarna is SPACA6 geëlueer met 'n lineêre gradiënt van 0 tot 500 mm NaCl in 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 vir 25 OK.Na ioonuitruilchromatografie is SPACA6 gekonsentreer tot 1 ml en isokraties geëlueer uit 'n ENrich SEC650 10 x 300 kolom (BioRad) wat met buffer B geëquilibreer is. Volgens die chromatogram, poel en konsentraat fraksies wat SPACA6 bevat.Suiwerheid is beheer deur Coomassie-gekleurde elektroforese op 'n 16% SDS-poliakrielamiedgel.Proteïenkonsentrasie is gekwantifiseer deur absorbansie by 280 nm deur die Beer-Lambert-wet en die teoretiese molêre uitsterwingskoëffisiënt te gebruik.
Gesuiwerde SPACA6 is oornag gedialiseer teen 10 mM natriumfosfaat, pH 7.4 en 150 mM NaF en verdun tot 0.16 mg/ml voor ontleding deur CD-spektroskopie.Spektrale skandering van CD's met 'n golflengte van 185 tot 260 nm is op 'n Jasco J-1500 spektropolarimeter versamel met behulp van kwartskuvette met 'n 1 mm optiese padlengte (Helma) by 25°C teen 'n tempo van 50 nm/min.Die CD-spektra is basislyn gekorrigeer, gemiddeld oor 10 verkrygings, en omgeskakel na gemiddelde residuele elliptisiteit (θMRE) in grade cm2/dmol:
waar MW die molekulêre gewig van elke monster in Da is;N is die aantal aminosure;θ is die ellipsiteit in milligrade;d stem ooreen met die lengte van die optiese pad in cm;proteïenkonsentrasie in eenhede.