310 10*1mm Roesvrye staal opgerolde buis chemiese komponent, Die N-terminale domeine van spidroin vorm hidrogels gebaseer op amiloïed fibrille en bied 'n platform vir proteïenimmobilisering.

Dankie dat jy Nature.com besoek het.Jy gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).Daarbenewens, om deurlopende ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.
Sliders wat drie artikels per skyfie wys.Gebruik die terug- en volgende-knoppies om deur die skyfies te beweeg, of die skyfiebeheerknoppies aan die einde om deur elke skyfie te beweeg.

Spesifikasie

310 10*1mm Vlekvrye staal opgerolde buis verskaffers

Chemiese samestelling

Meganiese eienskappe

Rekombinante spinnekop-syproteïene (spinnekop-syproteïene) het baie potensiële toepassings in die ontwikkeling van nuwe biomateriale, maar hul multimodale en aggregasie-geneigde aard maak dit moeilik om te verkry en maklik om te gebruik.Hier rapporteer ons dat rekombinante miniatuur spidroin-proteïene en, belangrik, die N-terminale domein (NT) self vinnig selfondersteunende en deursigtige hidrogels by 37 °C vorm.samesmeltingsproteïene wat bestaan ​​uit NT en groen fluoresserende proteïen of puriennukleosiedfosforilase vorm ten volle funksionele samesmeltingsproteïene.Hidrogels.Ons resultate toon dat rekombinante NT en samesmeltingsproteïene hoë uitdrukkingsopbrengste verskaf en hidrogels met aantreklike eienskappe soos deursigtigheid, gelering sonder kruisbinding en direkte immobilisasie van aktiewe proteïene by hoë digtheid verleen.
Spinnekoppe het soveel as sewe verskillende stelle sykliere, wat elkeen 'n spesifieke tipe sy produseer.Al sewe syspesies is saamgestel uit spinnekop-syproteïene (spindroins) ongeveer 6000 residue lank en bevat 'n groot sentrale herhalingsgebied omring deur sferiese N- en C-terminale domeine (NT en CT)1,2.Die mees bestudeerde tipe sy, die primêre ampulla, word deur die primêre ampullaklier vervaardig.In hierdie klier sintetiseer 'n monolaag epiteelselle spidroïneproteïene en skei dit in die lumen van die klier af, waar hulle in 'n oplosbare vorm (doping) teenwoordig is teen uiters hoë konsentrasies (30–50% w/v)3,4.Die organisasie en konformasie van die hoof ampulêre spidroïne-proteïene in die klier is gedebatteer, maar die meeste eksperimentele bewyse dui op die teenwoordigheid van 'n algemeen heliese en/of ewekansige heliese konformasie en micellêre of lamellêre strukture5,6,7,8,9,10.Terwyl die herhalende domeine meganiese eienskappe van syvesels reguleer, wat β-vel nanokristalle en amorfe strukture11,12,13,14,15 vorm, reguleer einddomeine syvesels in reaksie op veranderende toestande langs die syklier16,17,18.Deur sy vorming te beheer, 19. Terminale domeine word evolusionêr bewaar en hul funksie kan gemeen wees vir alle spidroin proteïene 2,20,21.Tydens deurgang deur die klier neem die pH van spidroin af van ongeveer 7.6 tot < 5.716 en neem toe met skuif en strek wat deur beweging deur die geleidelik vernouende kanaal bemiddel word.In oplossing is CT 'n α-helikale konstitutiewe parallelle dimeer17, maar in reaksie op lae pH en skuifkragte ontvou CT β-lae16, 17, wat moontlik β-lae in die herhalende streke van Convert 16 veroorsaak. NT is monomeries onder toestande wat toestande in die lumen van die klier weerspieël en die oplosbaarheid van spidroïn bemiddel, maar by verlaagde pH lei protonasie van 'n aantal karboksielsuursykettings tot dimerisasie van NT met 'n pKa van ongeveer 6.5, waardeur NT stabiliseer en spidroïn in groot fixeer hoeveelhede.netwerke16,18.Dus, NT speel 'n sleutelrol in filamentvorming, en verander van 'n monomeer in die laag na 'n dimeer in die vesel23,24,25.NT bly hoogs oplosbaar en helies onder alle toestande wat tot op hede bestudeer is16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, wat die ontwikkeling daarvan geïnspireer het as 'n oplosbaarheid-verbeterende etiket vir die produksie van heteroloë proteïene.
Rekombinante mini-spin-syproteïen, bestaande uit een NT, een kort herhalingsgebied, een CT, en 'n His6-merker (His-NT2RepCT) vir suiwering, is so oplosbaar in waterige buffer as inheemse spinnekop-syproteïen en boots inheemse belangrike eienskappe van syspinnekop na. .dekking 25.31.His-NT2RepCT kan in aaneenlopende vesels gespin word met behulp van 'n biomimetiese masjien waarin 'n pH 8 oplosbare deklaag in 'n pH 525,32,33,34,35 waterbad geëxtrudeer word.Bioreaktorfermentasie van E. coli wat His-NT2RepCT uitdruk en daaropvolgende nabehandeling het gelei tot >14 g/L opbrengs na suiwering.Die hoë opbrengs, hoë oplosbaarheid en voldoende reaksie van His-NT2RepCT op suur toestande word alles toegeskryf aan NT23, 25, 34.
Hier rapporteer ons die vinnige vorming van deursigtige hidrogels uit rekombinante spidroin-proteïene, insluitend NT alleen, deur 'n proteïenoplossing by 37 °C te inkubeer.Deur gebruik te maak van thioflavien T-fluoressensie (ThT), Fourier-transformasie-infrarooispektroskopie (FTIR), kernmagnetiese resonansiespektroskopie (NMR) en transmissie-elektronmikroskopie (TEM), het ons gevind dat NT- en mikrospinnekop-proteïene strukturele transformasie ondergaan in β-velle en amyloïedagtige fibrille wanneer gels gevorm word.Daarbenewens vorm samesmeltingsproteïene van NT en groen fluoresserende proteïen (GFP) of puriennukleosiedfosforilase (PNP) hidrogels met ten volle funksionele samesmeltingsfragmente.Hoë-deurset uitdrukking in heteroloë gashere, tesame met vinnige vorming van hidrogels onder fisiologiese toestande, open die moontlikheid van koste-effektiewe produksie van hidrogels met gemanipuleerde funksies.
Anders as die meeste gerapporteerde rekombinante spidroïnproteïene36, is His-NT2RepCT stabiel in Tris-HCl buffer by pH 8 en kan tot 500 mg/ml gekonsentreer word sonder neerslag25.Daarom was ons verbaas om te vind dat hierdie proteïen vinnig opties helder, selfondersteunende hidrogels vorm wanneer dit by 37°C geïnkubeer word (Fig. 1b-d).Verdere studies het getoon dat His-NT2RepCT gelering oor 'n wye reeks proteïenkonsentrasies (10-300 mg/ml) plaasgevind het en dat hierdie konsentrasie omgekeerd gekorreleer is met geleringstyd (Fig. 1c en Aanvullende Fig. 1).Om uit te vind watter dele van His-NT2RepCT hidrogelvorming bemiddel, het ons dan elke domein individueel en in verskillende kombinasies ondersoek met behulp van 'n fles-inversietoets (Figuur 1a,b).Alle getoetsde fraksies van rekombinante spidroïne het gels (teen 'n proteïenkonsentrasie van 300 mg/ml) in minder as 1 uur gevorm, behalwe vir neerslagte 2Rep (Fig. 1b).Dit dui daarop dat NT en CT alleen, in kombinasie, of geassosieer met herhalings, by 37°C kan gel en dat die His6-merker nie hierdie proses in enige beduidende mate beïnvloed nie.Gegewe die algemene idee dat NT 'n hoogs oplosbare en stabiele proteïen is, en dat vorige verslae van rekombinante spidroin hidrogels geleringseffekte toegeskryf het aan konformasieveranderinge in herhaalde streke en/of CT's, kan NT self.Die ontdekking van gelering was onverwags.Aanvullende Tabel 1) 37, 38, 39. Merkwaardig genoeg het NT reeds binne 10 minute gel teen 'n konsentrasie van ≥ 300 mg/ml (Fig. 1c).Flessie-inversie-eksperimente met verskeie konsentrasies NT het getoon dat teen >50 mg/ml die NT-oplossing vinniger gel het as His-NT2RepCT by die ooreenstemmende konsentrasie (w/v, Figuur 1c).
Skematiese voorstelling van verskeie spidroin-konstrukte wat in hierdie werk bestudeer is.b Gel tyd by 37 °C vir verskeie rekombinante spidroïn proteïene (300 mg/ml) geverifieer deur die flessie om te keer.CT-gel onmiddellik sonder inkubasie (<300 mg/ml), 2Rep presipiteer (300 mg/ml, 5 mm skaal).c Gel tyd van His-NT2RepCT en NT by aangeduide proteïenkonsentrasies by 37°C.d Foto's van His-NT2RepCT en NT hidrogels met onderskeidelik die spinnekop en die letter "NT" onder gedruk (albei 200 mg/mL, skaalbalk 5 mm).
Hidrogels wat deur verskeie rekombinante spidroin-proteïene gevorm word, het effens verskillende kleure, en waarneming met die blote oog toon verskillende grade van deursigtigheid (Fig. 1b).NT-gels is besonder helder terwyl ander gels ondeursigtig word.His-NT2RepCT- en NT-gels wat in silindriese buise gegiet is, kon ongeskonde uit die vorm verwyder word (Fig. 1d).
Om te toets of natuurlike spinnekop-sy-bedekkings jel onder toestande wat nou gevind word dat dit gelering van die rekombinante spinnekop-proteïene veroorsaak, is bedekkings van die groot ampullaklier van die Sweedse brugspinnekop (Larinioides sclopetarius) versamel.Bedekkings is gestoor in 20 mM Tris-HCl buffer teen 50 mg/ml (gebaseer op gemete droë gewig), maar geen gelering is waargeneem tydens die 21 dae inkubasie by 37 °C (Aanvullende Figuur 2a).
Om hierdie gels te kwantifiseer, kan reologiese metings gebruik word om die geleringsproses te bestudeer en die algehele meganiese eienskappe te bepaal.Die monitering van die bergingsmodulus (elastisiteit) by verhoogde temperature kan veral inligting verskaf oor die geleringstemperatuur sowel as die viskoelastiese eienskappe van die deklaag.Temperatuurstygingseksperimente (met 1°C/min by 25-45°C, gebaseer op vorige studies wat natuurlike syvoorraadoplossings gebruik)40,41 het getoon dat die bergingsmoduli van His-NT2RepCT en NT-oplossings toegeneem het met toenemende temperatuur.is verhoog (Fig. 2 en Aanvullende Fig. 3).Die NT-module het veral begin groei teen 'n laer temperatuur in vergelyking met His-NT2RepCT, in ooreenstemming met die vinniger geltyd wat waargeneem is toe NT direk met His-NT2RepCT by 37°C geïnkubeer is (Figuur 1).Na 'n daaropvolgende daling in temperatuur het die bergingsmodulus nie na laer waardes teruggekeer nie en bo die verliesmodulus gebly (sien Aanvullende Fig. 3), wat termies onomkeerbare stabiele gelering aandui.Na gelering het die finale elastiese modulus gewissel van 15 tot 330 kPa vir His-NT2RepCT hidrogels by 'n konsentrasie van 100–500 mg/mL, en die finale elastiese modulus vir NT hidrogels (100–500 mg/mL) het gewissel van 2 tot 1400 kPa (Fig. , 2 en volledige opritdata) sien Aanvullende Fig. 3).
a Verandering in temperatuur tydens metings van His-NT2RepCT (300 mg/mL) en b NT (300 mg/mL) met skud.Die pyle dui die temperatuurneiging aan, en die ligter skakering van die stoormodule-data toon toetsing teen laer wringkragwaardes vir die instrument as wat deur die vervaardiger gespesifiseer is, wat die oorsaak van die verhoogde geraas is.c Eindmodule-akkumulasie van His-NT2RepCT en NT na verhoogde temperatuur (100, 300 en 500 mg/ml).Alle modulelesings word teen 'n frekwensie van 0,1 Hz geneem.
As 'n potensiële metode om konformasieveranderinge wat met gelering verband hou, te ondersoek, het ons FTIR-spektra van His-NT2RepCT en NT voor en na gelering by 37°C aangeteken (Figuur 3a,b).Soos verwag, het die spektra van His-NT2RepCT en NT oplossings ooreengestem met proteïene wat α-heliks/ewekansige spoel sekondêre struktuur toon, met 'n uitgesproke band by 1645 cm-1.Vir beide hidrogels het gelering gelei tot die vorming van twee arms in die middelste I-band by ongeveer 1617 cm-1 en 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), wat die vorming van antiparallelle β-velstrukture aandui.Hierdie veranderinge kan ook duidelik gesien word in die onderskeie tweede afgeleide en verskil gelering spektra (Aanvullende Fig. 4b).Die twee bande van die NT β-laag was meer uitgesproke as dié van His-NT2RepCT, wat aandui dat die totale inhoud van β-laag bande in die NT hidrogel hoër was as dié van die NT2RepCT hidrogel.
'n FTIR-absorpsiespektra van His-NT2RepCT en b NT (albei 500 mg/mL) voor (oplossing) en na (gel) inkubasie by 37°C.c TEM-beelde van hersuspendeerde 50 mg/ml NT2RepCT-gels en d NT.Skaalbalk 200 nm.e Veseldiameters van His-NT2RepCT en NT hidrogels.n = 100 gemete fibrille, p < 0,0001.Die foutstawe wys die standaardafwyking.Die middel van die foutstawe is die gemiddelde.'n Ongepaarde t-toets (twee-stert) is vir statistiese analise gebruik.f ThT-fluoressensie van verskeie rekombinante spidroïne-proteïene (100 mg/ml) by 37 °C sonder om te skud.g NT (100 mg/ml) inenting eksperimente van 100 mg/ml NT gel met 0%, 5%, 10% en 20% sade.
Ontleding van die jel met behulp van transmissie-elektronmikroskopie (TEM) het getoon dat die hidrogel uit amiloïedagtige fibrille bestaan ​​(Fig. 3c, 3d).NT-gevormde fibrille was verleng (5-12 nm in deursnee) en onvertakte, terwyl His-NT2RepCT fibrille korter in lengte en aansienlik wyer in deursnee (7-16 nm) was (Fig. 3e).Hierdie resultate het ons in staat gestel om die kinetika van fibrose te volg deur die thioflavien T (ThT)-toets te gebruik.Vir alle rekombinante spidroin-proteïene het die fluoresserende sein toegeneem wanneer monsters by 37 °C geïnkubeer is (Fig. 3f, Aanvullende Fig. 5a).In ooreenstemming met hierdie bevinding, het mikroskopiese ondersoek van NT en His-NT2RepCT onder gelerende toestande 'n eenvormige toename in ThT-fluoressensie getoon sonder merkbare plaaslike ophoping van ThT-positiewe aggregate (Aanvullende Fig. 5b, c).Die vorming van ThT-positiewe fibrille het nie gepaard gegaan met 'n toename in NT en His-NTCT troebelheid nie (Aanvullende Fig. 5d), wat beteken dat 'n netwerk van fibrille in die jel kon vorm sonder om die helderheid van die gel te benadeel.Saai deur klein hoeveelhede voorafgevormde fibrille by te voeg, kan fibrilvorming van sommige amiloïede42,43,44 aansienlik versnel, maar die byvoeging van 5%, 10% of 20% (w/w) NT by 'n oplossing van NT hidrostollingsmiddels.saai-effek (Fig. 3g).Miskien is dit te wyte aan die feit dat die fibrille in die hidrogel relatief vas is en nie as sade gebruik kan word nie.
Die onverwagte gedrag van rekombinante spidroïne-proteïene by hoë temperature het verdere kernmagnetiese resonansie (KMR)-spektroskopiestudies aangespoor om konformasieveranderinge wat met jelvorming geassosieer word, te identifiseer.KMR-spektra van His-NT2RepCT-oplossings wat oor tyd by 37°C aangeteken is, het getoon dat CT steeds gedeeltelik gevou is, terwyl NT- en 2Rep-seine verdwyn het (Fig. 4a), wat daarop dui dat dit hoofsaaklik NT en 2Rep was wat die vorming van His- gedeeltelik beheer het. NT2RepCT hidrogel.Die CT-sein is ook verswak tot 20% van sy oorspronklike intensiteit, wat daarop dui dat CT ook meestal vasgemaak en in die hidrogelstruktuur geïnkorporeer is.Vir 'n kleiner gedeelte van die CT, wat so mobiel is soos in die vooraf geïnkubeerde monster en dus waargeneem deur oplossing KMR, het die spektra nie seine vir die eerste 10 gestruktureerde residue nie, moontlik as gevolg van moeilike immobilisering van die aangehegte gedeelte van His-NT2Rep.Die KMR-spektra van die -toestand van hidrogels -NT2RepCT het die oorheersende teenwoordigheid van α-helikse en β-lae geopenbaar en, in 'n mindere mate, die ewekansige spoelkonformasie (Fig. 4b).Chemiese verskuiwinganalise van metionienreste wat slegs in NT teenwoordig is, het getoon dat hierdie domein na 'n β-velstruktuur omgeskakel is.Die tydafhanklike spektra van NT in oplossing het 'n eenvormige afname in seinintensiteit getoon (Fig. 4c), en vaste-toestand KMR van NT hidrogels het getoon dat die meeste van die NT-residue omgeskakel is na β-velstrukture (Figuur 4d).Die konformasie van 2Rep kon nie afsonderlik bepaal word nie as gevolg van sy neiging om saam te voeg.Die vaste toestand KMR spektra van die NTCT en His-NT2RepCT hidrogel het egter baie soortgelyk gelyk (Fig. 4b; Aanvullende Fig. 6b), wat daarop dui dat 2Rep min bygedra het tot die strukturele deel van die His-NT2RepCT hidrogel.Vir CT hidrogels is gevind dat α-helikse, β-velle en ewekansige heliese sekondêre strukture bestaan ​​(Aanvullende Fig. 6d).Dit dui daarop dat sommige dele van die CT α-helikse bly terwyl ander β-velle word.Dus, die resultate van KMR spektroskopie dui daarop dat NT belangrik is vir hidrogel vorming en ook transformeer in 'n β-vel konformasie by samesmelting met 2Rep en CT.In ooreenstemming hiermee, het ons onlangs gevind dat amyloïed ruimtelike ritssluiters waarskynlik in al vyf helices van die NT-domein vorm, en die Waltz-algoritme het 'n amyloïdogene streek in heliks 1 voorspel (Fig. 4e).
2D-spektra van 15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT-oplossing voor (blou) en 19 uur na inkubasie (rooi) by 37°C.Individuele kruispieke in die rooi spektrum en F24, G136, polyA in die blou spektrum word aangedui deur enkelletter-aminosuursimbole en residunommers.Die insetsels toon die afhanklikheid van die seinintensiteit op tyd vir geselekteerde residue van die NT-, 2Rep- en CT-domeine.b Vastetoestand radiofrekwensie (RFDR) spektra van His-NT2RepCT hidrogels.Korrelasies van Cα/Cβ-reste wat in RFDR-spektra waargeneem is, is bepaal deur vergelyking met modelpeptied chemiese verskuiwings en waardes afgelei van statistieke82,83 en hul sekondêre strukture.SSB – roterende syband.c Eendimensionele spektra van 15N-HSQC 10 mg/mL NT-oplossing tydens inkubasie by 37 °C vir 36 uur.Die insetsel toon volumetriese intensiteit teenoor tyd.d Vastetoestand RFDR-spektra van NT hidrogels.Die korrelasies van Cα/Cβ-residu en hul sekondêre strukture wat in die RFDR-spektra waargeneem word, word aangedui.e Gebaseer op die NT45.79-fibrillasiegeneigdheidsprofiel vanaf die Zipper-databasis (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Die Rosetta-energie van die ruimtelike weerligskuifvenster van die heksapeptied word in kcal/mol getoon.Rooi stawe dui heksapeptiede aan met 'n hoë fibrose-geneigdheid (Rosetta-energie onder -23 kcal/mol; onder die stippellyn).Groen stawe dui fragmente aan met Rosetta-energieë bo die drumpel en dus minder geneig om steriese ritssluiters te vorm.Fragmente wat prolien bevat is van die analise uitgesluit (sonder kolomme).Vierkante dui areas van amiloïdose aan wat deur die Waltz-algoritme81 (https://waltz.switchlab.org) voorspel is.Die volgorde van aminosuurreste van NT is aan die bokant, en die tipes residue wat in die β sekondêre struktuur gevind word (bepaal deur vaste-toestand KMR-spektroskopie) word in rooi getoon.Die posisies van die vyf NT α-helikse word aangewys as (H1-H5)28.
By pH <6.5 dimeriseer HT, wat bestand is teen hitte- of ureum-geïnduseerde denaturasie18.Om toe te lig hoe NT-dimerisasie en stabiliteit gelering beïnvloed, is oplossings wat 100 mg/ml NT bevat het by pH 8, 7 en 6 gekontroleer deur gebruik te maak van die flessie-inversietoets.NT-monsters wat by pH 8 en 7 geïnkubeer is, het na 30 min by 37 °C gel, maar die pH 8-gel het helder gebly, terwyl die pH 7-gel 'n sigbare neerslag getoon het (Fig. 5a).Daarteenoor het 'n oplossing wat HT by pH 6 bevat het nie 'n jel gevorm nie, en 'n groot neerslag kon na 20 min by 37°C gesien word.Dit dui daarop dat dimere self en/of hul hoër stabiliteit in vergelyking met monomere gelvorming voorkom.Die vorming van 'n neerslag vir NT by pH 7 en 6 is nie verwag nie, aangesien dit gerapporteer is dat NT oplosbaar is teen 200 mg/ml27, maklik hervou na hitte-denaturering, en ook 'n α-heliks by laer waardes van pH 18. 'n Waarskynlike verklaring vir hierdie verskille is dat die voorheen gerapporteerde eksperimente by kamertemperatuur of laer uitgevoer is, of teen relatief lae proteïenkonsentrasies16,18,19.
NT-flessie-inversietoets (100 mg/ml) by pH 8, 7, 6 en 154 mM NaCl (pH 8) na inkubasie by 37°C.b NT CD-spektra met en sonder 154 mM NaF en 154 mM NaCl, onderskeidelik.Molêre elliptisiteit by 222 nm word omgeskakel na 'n proporsie natuurlike voue.c NT-inversietoets (100 mg/ml) NT* (37 °C en 60 °C), NTA72R (37 °C), en His-NT-L6 (37 °C en 60 °C).d CD-spektra van NT-mutante NT*, NTA72R en His-NT-L6.Molêre elliptisiteit by 222 nm word omgeskakel na 'n proporsie natuurlike voue.e Inversietoets van NTFlSp, NTMiSp en verminderde NTMiSp (100 mg/ml).Skaalbalk 5 mm.f CD-spektra van NT, NTFlSp, NTMiSp en verminderde NTMiSp.Molêre elliptisiteit by 222 nm word omgeskakel na 'n proporsie natuurlike voue.Volle NT-spektra by 25 °C en 95 °C word in Aanvullende Figuur 8 getoon.
Fisiologiese soutkonsentrasie bepaal elektrostatiese interaksies tussen NT subeenhede en dimerisasie van NT oordrag na laer pH18.Ons het gevind dat die teenwoordigheid van 154 mM NaCl en NaF inderdaad gelering onderskeidelik inhibeer het (Fig. 5a, b; Aanvullende Fig. 2b) en dat hierdie soute die termiese stabiliteit van NT-monomere verhoog het (Fig. 5b, Aanvullende Fig. 8). .Dit dui ook daarop dat stabiliteitsverbetering, eerder as dimerisering, gelvorming voorkom.
Om die rol van proteïendimerisasie en stabiliteit in gelering verder te ondersoek, het ons twee mutante gebruik, NT* en NTA72R, wat ook monomeer bly by lae pH28.30.NT* is 'n dubbellading-omkeermutant waarin die oënskynlike dipolêre ladingverspreiding van die monomeer afgeplat word, wat dimerisasie voorkom en monomeerstabiliteit drasties verhoog.NTA72R is 'n gelaaide dipool, maar Arg-gesubstitueerde Ala is by die dimeergrens geleë, dus mutasies meng in met subeenheid interaksies wat nodig is vir dimerisasie.Met inkubasie by 37°C het NT* nie 'n hidrogel gevorm nie, terwyl NTA72R 'n ondeursigtige jel vir 15 min gevorm het (Fig. 5c).Aangesien beide NT* en NTA72R nie kan dimeriseer nie maar verskil in monomeerstabiliteit (Fig. 5d), dui hierdie resultate sterk daarop dat hoë termodinamiese stabiliteit verhoed dat NT gel.Dit word ook ondersteun deur die feit dat HT* 'n jel vorm wanneer dit by hoë temperatuur onstabiel is (na 8 min by 60°C; Fig. 5c).Daar is voorheen aangetoon dat die hoë inhoud van metionien in NT die natuurlike vou daarvan vloeibaar maak en dat ses Met tot Leu substitute (hier na verwys as His-NT-L6) die NT46 monomeer sterk stabiliseer.Gebaseer op die aanname dat strukturele buigsaamheid nodig is vir NT-gelvorming, het ons gevind dat die His-NT-L6 stabiele mutant nie by 37 °C gel nie (Figuur 5c, d).His-NT-L6 het egter ook 'n jel gevorm tydens inkubasie by 60°С vir 60 min (Fig. 5c).
Die vermoë van NT om in β-velstrukture te transformeer en hidrogels te vorm blyk van toepassing te wees op sommige maar nie al die NT-domeine van spidroin nie.NT'e van verskillende sytipes en spinnekopspesies, Trichonephila clavipes (NTFlSp), het gels gevorm ten spyte van hul relatief lae metionieninhoud en hoë termiese stabiliteit (Fig. 5e, f en Aanvullende Tabel 2).Daarteenoor het NT van die klein ampulêre proteïen spidroin van Araneus ventricosus (NTMiSp) met lae termiese stabiliteit en hoë metionieninhoud nie hidrogels gevorm nie (Aanvullende Tabel 2 en Fig. 5e, f).Laasgenoemde kan geassosieer word met die teenwoordigheid van intramolekulêre disulfiedbindings29,47.Konsekwent, wanneer die disulfiedbindings van NTMiSp verminder is, het dit 'n hidrogel gevorm na inkubasie by 37°C vir 10 min (Fig. 5e).Ten slotte moet daarop gelet word dat strukturele buigsaamheid 'n belangrike, maar nie die enigste, maatstaf is vir die vorming van 'n jel uit NT nie.Nog 'n faktor wat relevant kan wees, is die geneigdheid om amyloïed fibrille te vorm, en analise met die rits databasis en die Waltz algoritme het wel 'n korrelasie getoon tussen die vermoë om gels te vorm en die teenwoordigheid van amyloïdogene streke, asook die omvang van die streke wat voorspel is. steriese ritsen te vorm.Daar was 'n korrelasie (Aanvullende Tabel 2 en Aanvullende Fig. 9).
Die vermoë van NT om fibrille te vorm en gels te vorm onder gunstige toestande het ons laat vermoed dat NT-fusies met ander proteïenfragmente steeds gels kan vorm met volle funksie van samesmeltingsvennote.Om dit te toets, het ons onderskeidelik groen fluoresserende proteïen (GFP) en puriennukleosiedfosforilase (PNP) by die C-terminus van die NT ingebring.Die resulterende samesmeltingsproteïene is uitgedruk in E. coli met baie hoë finale opbrengste (150 mg/L en 256 mg/L skudfleskulture vir onderskeidelik His-NT-GFP en His-NT-PNP), in ooreenstemming met wat getoon is vir Ander proteïene saamgesmelt met NT Verw.30. His-NT-GFP (300mg/ml) en His-NT-PNP (100mg/ml) samesmeltingsproteïene het gels gevorm na 2 uur en 6.5 uur by 37°C en, belangrik, die GFP fraksie het onveranderd gebly.waargeneem na gelering, met >70% van die aanvanklike fluoressensie-intensiteit wat oorbly na gelering (Fig. 6a).Om PNP-aktiwiteit in sy-NT-PNP-oplossings en gels te meet, moes ons die samesmeltingsproteïen met NT verdun omdat die ensiematiese aktiwiteit van die suiwer preparaat buite die deteksiebereik van die toets was by gelkonsentrasies.Die jel wat gevorm is met 'n mengsel wat 0.01 mg/ml His-NT-PNP en 100 mg/ml NT bevat het, het 65% van die aanvanklike ensiematiese aktiwiteit van die vooraf geïnkubeerde monsters behou (Fig. 6b).Die jel het ongeskonde gebly tydens die meting (Aanvullende Fig. 10).
a Relatiewe fluoressensie-intensiteit voor en na gelering van His-NT-GFP (300 mg/ml) en omgekeerde flessie wat His-NT-GFP hidrogel (300 mg/ml) bevat onder sigbare en UV-lig.Punte wys individuele metings (n = 3), foutstawe wys standaardafwyking.Die gemiddelde waarde word in die middel van die foutstawe gewys.b PNP-aktiwiteit is verkry deur fluorometriese analise met behulp van oplossings en gels bestaande uit NT (100 mg/ml) en 'n mengsel wat 0.01 mg/ml his-NT-PNP en 100 mg/ml New Taiwan dollars bevat.Die insetsel toon 'n omgekeerde flessie wat 'n hidrogel bevat wat His-NT-PNP bevat (5 mm skaalstaaf).
Hier rapporteer ons die vorming van hidrogels vanaf NT en ander rekombinante spidroin-proteïene deur 'n proteïenoplossing by 37 ° C te inkubeer (Figuur 1).Ons toon dat gelering geassosieer word met die transformasie van α-helikse in β-lae en die vorming van amiloïedagtige fibrille (Fig. 3 en 4).Hierdie bevinding is verbasend aangesien NT's opgerolde bolvormige vyf-heliks bundels is wat bekend is vir hul uiters hoë oplosbaarheid en hoë stabiliteit by konsentrasies >200 mg/ml by 4°C vir etlike dae27.Daarbenewens hervou NT'e maklik na hitte-denaturering by lae proteïenkonsentrasies in µM.Volgens ons resultate vereis fibrilvorming 'n kombinasie van >10 mg/ml proteïenkonsentrasie en effens verhoogde temperatuur (Fig. 1).Dit stem ooreen met die idee dat amiloïed fibrille kan vorm uit globulêr gevoude proteïene wat in 'n gedeeltelik ontvoude toestand is as gevolg van termiese skommelinge onder fisiologiese toestande 48 .Voorbeelde van proteïene wat hierdie omskakeling ondergaan, sluit in insulien49,50, β2-mikroglobulien, transtiretien en lisosiem51,52,53.Alhoewel NT 'n α-heliks in sy oorspronklike toestand is, is ongeveer 65% van die polipeptiedketting versoenbaar met steriese ritssluiting (Fig. 4e) 45 .Aangesien die monomeer dinamies mobiel is46, kan dit hierdie potensiële amyloïdogene streke by matig verhoogde temperature blootstel en by hoë konsentrasies totale proteïen kan dit 'n kritieke konsentrasie vir amyloïed fibril vorming bereik54.Na aanleiding van hierdie redenasie het ons 'n negatiewe korrelasie tussen spidroïnkonsentrasie en geleringstyd gevind (Fig. 1c), en as die monomeriese NT-konformasie gestabiliseer word óf deur mutasies (NT*, His-NT-L6) óf deur soutbyvoeging, kan die vorming hidrogels (Fig. 5).
In die meeste gevalle verdwyn amiloïed fibrille uit oplossing as 'n neerslag, maar onder sekere toestande kan hulle hidrogels vorm55,56,57.Hidrogel-vormende fibrille het tipies 'n hoë aspekverhouding en vorm stabiele driedimensionele netwerke deur molekulêre verstrengeling,55,58 in ooreenstemming met ons resultate.Vir hidrogelvorming in vitro word proteïene dikwels ten volle of gedeeltelik ontvou, byvoorbeeld deur blootstelling aan organiese oplosmiddels, hoë temperatuur (70–90°C) en/of lae pH (1.5–3.0)59,60,61,62.Die spidroin-hidrogels wat hier beskryf word, benodig nie harde verwerking nie, en vereis ook nie kruisbindingsmiddels om die hidrogels te stabiliseer nie.
Daar is voorheen gerapporteer dat spidroin-herhalings en QD's, wat blykbaar β-velwisseling tydens syspin ondergaan, hidrogels vorm.In vergelyking met ons bevindinge was inkubasietye en/of inkubasietemperature onderskeidelik aansienlik langer of hoër, en die gevolglike hidrogels was dikwels ondeursigtig (Figuur 7 en Aanvullende Tabel 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Benewens vinnige jel tye, het NT hidrogels >300 mg/ml (30%) beter gevaar as alle ander beskryfde rekombinante spinnekop syproteïen hidrogels, sowel as natuurlike hidrogels soos gelatien, alginaat (2%), agar (0,5 %) ) en kollageen.(0.6%) (Figuur 7 en Aanvullende Tabelle 1 en 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Die gel tyd en elastiese modulus van die hidrogels in hierdie studie is vergelyk met ander spidroin-gebaseerde hidrogels en geselekteerde natuurlike hidrogels.Verwysings word gegee saam met 'n beskrywing van die geleringstoestande.APS Ammoniumpersulfaat, kamertemperatuur.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Spinnekoppe het blykbaar maniere ontwikkel om te voorkom dat spinnekoppe tydens berging gel.Ten spyte van die hoë konsentrasie proteïen in die syklier, beteken die groot herhalingsgebied wat met die terminale domein geassosieer word dat die oënskynlike konsentrasie van NT en CT in die klier ooreenstem met ongeveer 10-20 mg/ml, by die grens van hierdie studie.benodig vir in vitro waargenome hidrogelvorming.Daarbenewens het soortgelyke konsentrasies soute 16 NT gestabiliseer, soos in sykliere (Fig. 5b).NT-konformasie is bestudeer in die E. coli sitosol en gevind dat dit meer styf gevou is as wanneer dit in vitro ondersoek word, wat verder aandui dat sout of ander faktore die aggregasie daarvan in vivo verhoed.Die vermoë van NT'e om in β-vel fibrille te transformeer kan egter belangrik wees vir filamentvorming en moet in toekomstige studies ondersoek word.
Benewens die nuwe aspekte van NT-amyloïedagtige fibril- en hidrogelvorming wat in hierdie studie waargeneem is, toon ons ook dat hierdie verskynsel biotegnologiese en biomediese toepassings kan hê (Fig. 8).As 'n bewys van konsep het ons NT met GFP of PNP gekombineer en getoon dat die samesmeltingsproteïen ook hidrogels vorm wanneer dit by 37 °C geïnkubeer word en dat die GFP- en PNP-fraksies grootliks hul aktiwiteit behou na gelering (Figuur 6).Nukleosiedfosforilases is belangrike katalisators van sintese van nukleosiedanaloë75, wat ons ontdekking relevant maak vir die biofarmaseutiese industrie.Die konsep van die uitdrukking van samesmeltingsproteïene wat deursigtige hidrogels vorm onder gunstige toestande laat die skepping van gefunksionaliseerde hidrogels met gunstige eienskappe vir 'n wye reeks toepassings soos ensiemimmobilisasie, beheerde geneesmiddelvrystelling en weefselingenieurswese toe.Daarbenewens is NT en NT* doeltreffende uitdrukkingsmerkers30, wat beteken dat NT en sy variante gebruik kan word vir hoë deursetproduksie van oplosbare samesmeltingsproteïene en daaropvolgende skepping van geïmmobiliseerde teikenproteïene in 3D hidrogels.
NT is oplosbaar, α-helikaal en stabiel teen lae konsentrasies (µM) en 37°C.By dieselfde temperatuur, maar by toenemende konsentrasies (>10 mg/ml), vorm NT gels wat uit amiloïedagtige fibrille bestaan.NT-fusieproteïene vorm ook fibrillêre gels met ten volle funksionele samesmeltingsfragmente, waardeur verskeie proteïene geïmmobiliseer kan word in 3D hidrogels met behulp van NT.Onder: NT (PDB: 4FBS) en illustrasies van veselnetwerke en gepaardgaande proteïenstrukture (aangeneem en nie volgens skaal geteken nie, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ).
Die konstrukte (sien Aanvullende Tabel 4 vir 'n volledige lys insluitend aminosuurvolgorde) is in plasmied pT7 gekloneer en in E. coli BL21 (DE3) getransformeer.E. coli wat gemanipuleerde plasmiede bevat is geënt in Luria sous aangevul met kanamisien (70 mg/l) en oornag gegroei teen 30°C en 250 rpm.Die kultuur is dan 1/100 in LB medium wat kanamisien bevat geënt en by 30°C en 110 rpm gekweek totdat die OD600 0.8 bereik het.Vir KMR-studies is bakterieë in M9 minimale medium gekweek wat 2 g D-glukose 13C (Aldrich) en 1 g ammoniumchloried 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) bevat het vir proteïenetikettering met isotope.Verlaag die temperatuur tot 20 grade Celsius en veroorsaak proteïenuitdrukking met 0.15 mM isopropyltiogalaktopiranoside (finale konsentrasie).Na oornag proteïen uitdrukking, is selle geoes by 7278×g, 4°C vir 20 min.Selkorrels is hersuspendeer in 20 mM Tris-HCl, pH 8, en gevries tot verdere gebruik.Ontdooide selle is met behulp van 'n selontwrigter (TS-reeksmasjiene, Constant Systems Limited, Engeland) by 30 kPa gelys.Daarna is die lysate by 25 000 g vir 30 minute by 4°C gesentrifugeer.Vir NTMiSp is die korrel dan gehersuspendeer in 2 M ureum, 20 mM Tris-HCl, pH 8, en vir 2 min (2 s aan/af, 65%) gesoniceer, en dan weer gesentrifugeer by 25 000 xg, 4° C. binne 30 min.Die supernatant is op 'n Ni-NTA kolom gelaai, gewas met 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidasool, pH 8, en uiteindelik is die proteïen geëlueer met 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidasool, pH 8. Om NT2RepCT en NTCT, trombienvertering stel die plek (ThrCleav) tussen His en NT bekend.Trombiensplitsingsplekke is ook teenwoordig in His-NT-ThrCleav-2Rep (produseer 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produseer NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produseer CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produseer NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produseer NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produseer NTF1Sp), en His-Swael Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produseer NTMiSp).Die konstrukte is met trombien (1:1000) verteer en oornag by 4°C gedialiseer met 20 mM Tris-HCl, pH 8, deur gebruik te maak van 'n Spectra/Por dialise membraan met 'n molekulêre gewig drempel van 6-8 kDa.Na dialise word die oplossing op 'n Ni-NTA-kolom gelaai en die uitvloeisel wat die proteïen van belang bevat, word versamel.Proteïenkonsentrasies is bepaal deur UV-absorbansie by 280 nm te meet deur die uitsterwingskoëffisiënt van elke proteïen te gebruik, behalwe vir NTF1Sp, wat die Bradford-toets volgens die vervaardiger se protokol gebruik het.Suiwerheid is bepaal deur SDS poliakrielamied (4–20%) gelelektroforese en Coomassie briljante blou kleuring.Proteïene is gekonsentreer deur middel van sentrifugefilters (VivaSpin 20, GE Healthcare) by 4000 xg met 'n 10 kDa molekulêre gewig afsny in 20 minute siklusse.
Ontdooi die proteïenoplossing en pipet 150 µl versigtig in 'n 1 ml deursigtige septumflessie (8 x 40 mm Thermo Scientific).Die buise is bedek en met parafilm verseël om verdamping te voorkom.Monsters (n = 3) is by 37°C of 60°C geïnkubeer en periodiek omgekeer om gelering waar te neem.Monsters wat nie gel het nie, is vir ten minste een week geïnkubeer.Verminder NTMiSp disulfiedbindings met 10 mM DTT per 10 µM proteïen.Om die gelering van natuurlike spinnekop-sybedekkings te ontleed, is die Sweedse brugspinnekop gesny, die twee hoof-geampulleerde kliere is in 200 μl 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 geplaas en gesny om die deklaag van die kliere te laat skei..Die inhoud van die kliere word opgelos in buffer, 50 µl vir bepaling van droë gewig (deur inkubasie van oop flessies by 60 °C tot konstante gewig) en 150 µl vir gelering by 37 °C.
Die meetgeometrie/gereedskap is gemaak van vlekvrye staal met behulp van 'n parallelle plaat met 'n boonste deursnee van 20 mm en 'n gaping van 0,5 mm.Verhit die monster van 25 °C tot 45 °C en terug na 25 °C teen 'n tempo van 1 °C per minuut deur 'n Peltier-plaat van vlekvrye staal onder te gebruik.Vibrasiemetings is uitgevoer teen 'n frekwensie van 0.1 Hz en in die lineêre viskoelastiese area van die materiaal teen 'n spanning van 5% en 0.5% vir monsters van 100 mg/ml en 300–500 mg/ml, onderskeidelik.Gebruik 'n pasgemaakte humiditeitskamer om verdamping te voorkom.Data is met Prism 9 ontleed.
Vir die versameling van infrarooi (IR) spektra by kamertemperatuur van 800 tot 3900 cm–1.Die ATR-toestel, sowel as die ligpad deur die spektrometer, word voor en tydens die eksperiment met droë gefiltreerde lug gesuiwer.Oplossings (500 mg/ml om waterabsorpsiepieke in die spektra te minimaliseer) is op die kristalle gepipetteer, en gels (500 mg/ml) is gevorm voor meting en dan oorgedra na die kristalle (n = 3).1000 skanderings is aangeteken met 'n resolusie van 2 cm-1 en 'n nuldienssiklus van 2. Die tweede afgeleide is bereken deur OPUS (Bruker) te gebruik met 'n gladmaakreeks van nege punte.Die spektra is genormaliseer na dieselfde integrasiegebied tussen 1720 en 1580 cm-1 met behulp van F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.In ATR-IR-spektroskopie is die penetrasiediepte van 'n infrarooi bundel in 'n monster golfgetalafhanklik, wat lei tot sterker absorpsie by laer golfgetalle as by hoër golfgetalle.Hierdie effekte is nie gekorrigeer vir die spektra wat in Fig.3 omdat hulle baie klein is (Aanvullende Fig. 4).Gekorrigeerde spektra vir hierdie syfer is bereken deur gebruik te maak van die Bruker OPUS sagteware.
In beginsel is 'n omvattende kwantifisering van proteïenkonformasies moontlik na betroubare dekonvolusie van die komponente binne die amied I-piek.Sommige struikelblokke ontstaan ​​egter in die praktyk.Geraas in die spektrum kan verskyn as (vals) pieke tydens dekonvolusie.Daarbenewens val die piek as gevolg van waterbuiging saam met die posisie van die amied I-piek en kan 'n soortgelyke grootte hê vir monsters wat 'n groot hoeveelheid water bevat, soos die waterige jel wat hier bestudeer word.Daarom het ons nie probeer om die amied I-piek heeltemal te ontbind nie, en ons waarnemings moet slegs oorweeg word ter ondersteuning van ander metodes soos KMR-spektroskopie.
Oplossings van 50 mg/ml NT en His-NT2RepCT is oornag by 37°C gel.Die hidrogel is dan verdun met 20 mM Tris-HCl (pH 8) tot 'n konsentrasie van 12.5 mg/ml, goed geskud en gepipetteer om die jel te breek.Vervolgens is die hidrogel 10 keer verdun met 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl van die monster is toegedien op 'n koperrooster wat met formvar bedek is, en die oortollige monster is met kladpapier verwyder.Monsters is twee keer met 5 µl MilliQ water gewas en vir 5 minute met 1% uranielformiaat gekleur.Verwyder oortollige vlek met absorberende papier, dan lugdroog die gaas.Beeldvorming is op hierdie roosters uitgevoer met behulp van 'n FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN wat op 100 kV werk.Die beelde is opgeneem teen x 26 500 en x 43 000 vergrotings met behulp van 'n Veleta 2k × 2k CCD-kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Duitsland).Vir elke monster (n = 1), is 10-15 beelde aangeteken.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) is gebruik vir beeldanalise en meting van veseldiameters (n = 100, verskillende vesels).Prisma 9 is gebruik om ongepaarde t-toetse (twee-stert) uit te voer.Die gemiddelde His-NT2RepCT en NT fibrille was onderskeidelik 11.43 (SD 2.035) en 7.67 (SD 1.389) nm.Die vertrouensinterval (95%) is -4,246 tot -3,275.grade van vryheid = 198, p < 0,0001.
80 µl vloeistofmonsters wat 10 µM thioflavien T (ThT) bevat, is in drievoud (n = 3) onder statiese toestande gemeet deur gebruik te maak van Corning 96-put swart bodem deursigtige bodemplate (Corning Glass 3881, VSA).Fluoresentasieverskille is aangeteken met behulp van 'n 440 nm opwekkingsfilter en 'n 480 nm emissiefilter (FLUOSTar Galaxy van BMG Labtech, Offenburg, Duitsland).Die ThT-sein was nóg versadig nóg geblus, aangesien eksperimente met verskillende konsentrasies ThT uitgevoer is sonder om die seinintensiteit te verander.Teken absorpsie by 360 nm aan vir waasmeting.Vir saadeksperimente is 100 mg/ml gels by 37°C gevorm, hersuspendeer en gebruik vir saad teen molêre verhoudings van 5%, 10% en 20%.Data is met Prism 9 ontleed.
Ontdooi voorraad van His-NT2RepCT en NT >100 mg/ml op ys en filtreer deur 'n 0.22 µm filter.Konsentrasies is bereken deur absorbansie by 280 nm met behulp van Nanodrop te meet.In putte van 'n 96-put swart nie-bindende plaat (Corning) met 'n duidelike bodem, is monsters verdun tot 20 mg/ml in 20 mM Tris-HCl pH 8 en gemeng met 5 μM ThT (eindkonsentrasie), totale monsterkonsentrasie 50 μl volume.Monsters is elke 10 minute afgeneem by 37 °C op 'n CellObserver (Zeiss) mikroskoop met oorgedrade ligkanaal en FITC opwekking en emissie filter stelle vir ThT beelding.’n 20x/0.4-lens word vir beeldvorming gebruik.Zen Blue (Zeiss) en ImageJ (https://imagej.nih.gov/) is vir beeldanalise gebruik.Jelle is ook voorberei uit NT en His-NT2RepCT oplossings teen 'n konsentrasie van 50 mg/ml wat 20 mM Tris pH 8 en 5 µM ThT bevat en vir 90 min by 37°C geïnkubeer.Die jelstukke is oorgedra na 'n nuwe put wat 20 mM Tris, pH 8 en 5 μM ThT in 'n nie-bindende swart 96 putte deursigtige bodemplaat bevat.Verkry groen fluoressensie en helder veldbeelde teen 20x/0.4 vergroting.ImageJ is gebruik vir beeldanalise.
Oplossing KMR spektra is verkry by 310 K op 'n 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometer toegerus met 'n QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).KMR-monsters wat 10 mg/mL homogene proteïen bevat gemerk met 13C, 15N, opgelos in 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Chemiese verskuiwings van NT2RepCT by pH 6.7 is gebruik om piek 23 in die 2D-spektrum van 15N-HSQC toe te ken.
Magiese hoek draaiende vaste NMR (MAS) spektra van 13C, 15N-gemerkte hidrogels is op 'n Bruker Avance III HD spektrometer by 800 MHz toegerus met 'n 3.2 mm 13C/15N{1H} elektronlose sonde aangeteken.Monster temperatuur is beheer deur gebruik te maak van 'n veranderlike temperatuur gasstroom by 277 K. Twee-dimensionele dipool rotasie resonansie (DARR)76 en radiofrekwensie heraansluiting (RFDR)77 spektra is verkry by MAS frekwensies van 12.5 kHz en 20 kHz, onderskeidelik.Kruispolarisasie (CP) van 1H tot 13C is uitgevoer deur gebruik te maak van 'n lineêre helling van 60.0 tot 48.0 kHz by 1H, 61.3/71.6 kHz by 13C (by 12.5/20 kHz MAS) en kontaktyd 0.5–1 ms.Spinal6478-ontkoppeling by 73.5 kHz is tydens data-insameling gebruik.Die verkrygingstyd was 10 millisekondes en die siklusvertraging was 2,5 sekondes.Die enkelgekoppelde Cα/Cβ-korrelasies wat in die RFDR-spektra waargeneem is, is toegeken op grond van die kenmerkende residu-tipe chemiese verskuiwings en meervoudig gekoppelde korrelasies in die DARR-spektra.
Die Zipper79-databasis (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) is gebruik om fladderneigings en Rosetta-energie vir NT, NTFlSp en NTMiSp te evalueer.Die Zipper-databasis bereken Rosetta Energy80, wat verskeie gratis energiefunksies kombineer om proteïenstruktuur te modelleer en te ontleed.'n Energievlak van -23 kcal/mol of laer dui op 'n hoë neiging om te fibrilleer.Die laer energie beteken meer stabiliteit van die twee β-stringe in die rits konformasie.Daarbenewens is die Waltz-algoritme gebruik om amyloïdogene streke in NT, NTFlSp en NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Die NT-proteïenoplossing is gemeng met 2-(N-morfolino)etaansulfonsuur (MES) buffer by pH 5.5 en 6.0 om die pH te verlaag tot onderskeidelik pH 6 en 7.Die finale proteïenkonsentrasie was 100 mg/ml.
Metings is uitgevoer op 'n J-1500 CD spektrometer (JASCO, VSA) met behulp van 'n 300 μL kuvet met 'n optiese pad van 0.1 cm.Proteïene is verdun tot 10 μM (n = 1) in 20 mM fosfaatbuffer (pH 8).Om proteïenstabiliteit in die teenwoordigheid van sout te ontleed, is proteïene teen dieselfde konsentrasie (n = 1) in 20 mM fosfaatbuffer (pH 8) wat onderskeidelik 154 mM NaF of NaCl bevat, ontleed.Temperatuurskanderings is aangeteken by 222 nm vanaf 25°C tot 95°C met 'n verhittingstempo van 1°C/min.Die proporsie van inheemse gevoude proteïene is bereken deur gebruik te maak van die formule (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Daarbenewens is vyf spektra aangeteken vir elke monster vanaf 260 nm tot 190 nm by 25°C en na verhitting tot 95°C.Vyf spektra is gemiddeld, glad gemaak en omgeskakel na molêre elliptisiteit.Data is met Prism 9 ontleed.
Die fluoressensie-intensiteit van His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µL) is gemeet in drievoud (n = 3) in 96-put Corning plate met 'n swart deursigtige bodem (Corning Glass 3881, VSA) onder statiese toestande.Meet monsters met 'n fluoressensie-gebaseerde plaatleser met 'n opwekkingsgolflengte van 395 nm en teken die emissie aan by 509 nm voor gelering en 2 uur later by 37°C.Data is met Prism 9 ontleed.
Puriennukleosiedfosforilase-aktiwiteittoetsstel (fluorometriese metode, Sigma Aldrich) is volgens die vervaardiger se instruksies gebruik.Om aktiwiteit te meet in gels en oplossings wat His-NT-PNP bevat, meng 10 ng His-NT-PNP met 100 mg/ml NT tot 'n totale volume van 2 µL omdat die jel 'n sein gegee het bo die opsporingsinterval van die stel.Kontroles vir gels en oplossings sonder His-NT-PNP is ingesluit.Die metings is twee keer uitgevoer (n = 2).Nadat die aktiwiteit gemeet is, is die reaksiemengsel verwyder en die jel gefotografeer om te verseker dat die jel ongeskonde gebly het tydens die meting.Data is met Prism 9 ontleed.
Vir meer inligting oor studie-ontwerp, sien die Nature study abstract gekoppel aan hierdie artikel.
Figure 1 en 2 bied die aanvanklike data aan.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f en 6, Aanvullende Fig.3, aanvullende fig.5a, d, aanvullende fig.6 en aanvullende fig.8. Data Data van hierdie studie word gehuisves in die Zenodo-databasis https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Die KMR-data wat in hierdie studie verkry is, is na die BMRBig-bewaarplek geplaas onder die inskrywing ID bmrbig36.Die strukture van GFP en PNP is geneem uit PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. en Johansson, J. Spinning van kunsspinnekop.Nasionale Chemiese.biologie.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Die Nephila clavipes genoom beklemtoon die diversiteit van spinnekop sy gene en hul komplekse uitdrukking.Nasionale Genette.49, 895–903 (2017).